糖尿病视网膜病变患者血清和糖尿病大鼠视网膜中BDNF的降低

张巍，杨宇光Δ

张巍，杨宇光Δ

中国医科大学附属盛京医院大连医院眼科，辽宁大连116000

【摘要】目的脑源性神经营养因子（brainderivedneurotrophicfactor，BDNF)最富含于视网膜内，因糖尿病不能凋整其水平，从而可以损害视恻膜。方法我们应用ELISA检测法检测了糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy，DR)患者血清中的BDNF和用链脲佐因素(streptozotocin，STZ)引起糖尿病大鼠血清和视网膜中的BDNF水平。结果在增殖性糖尿病视网膜病变(proliferativediabeticretinopathy,PDR)患者血清中的BDNF水平较非糖尿病健康对照组明显减少(10.0±8．1～25.8±8.5ng／ml，P<O.001)，比较无视网膜病变的糖尿病患者也明显减少(10.0±8.l～21.8±4.9ng／ml，P<0.001)，而糖尿病大鼠比较非糖尿病鼠对照组，其视网膜和血清中的BDNF也明显减少(P<O.05)。此外，用Westernblotting技术检测视网膜中原肌凝蛋白(tropomyosin)有关的激酶(TriB)受体表达水平，在糖尿病大鼠较非糖尿病对照组有明显降低(P<O.001)，、半胱氯酸蛋白酶Caspas-3的活性检测在引起糖尿病3w后的大鼠视网膜中却是增高的，且一直维持至10w仍然增高，与BDNF的水平呈负相关(r=-0.544，P=0.013)。结论糖尿病人的BDNF水平降低，可引起早期糖尿病视网膜的凋亡和神经变性，其后在DR中引起神经血管的损害。

【关键词】糖尿病视网膜病变；神经变性；脑源性神经营养因子；凋亡；血管新生

糖尿病视网膜病变（DR）是一严重威胁视力可使患者致盲的疾病，现在DR已被广泛人为是一种神经血管性疾病，而非既往只认为是一血管性病患。早期糖尿病患者的视网膜功能试验和在实验性糖尿病动物视网膜所做的细胞和分子学研究，都提示在糖尿病发生后短期内，出现任何血管损害症状前，其神经元脆弱而易受损害【1、2】。许多研究报告糖尿病可引起神经元的慢性丧失，由于凋亡率增加和神经胶质细胞活化，视网膜内神经胶质、神经元细胞和视网膜血管系统紧密的相互作用可维持视网膜正常功能所需要的内环境稳定【1、3】。在脑的活体和神经元细胞体外研究中，都发现神经元神经胶质细胞所产生的BDNF，能影响细胞的分化、突触接合、可塑性生长和细胞的存活【4、5】，然而BDNF在DR中的作用仍未完全清楚。本文重点介绍有关BDNF在DR患者血清及糖尿病啮齿动物视网膜和血清中的水平，探讨BDNF在DR发病机理中的可能作用。

1对象和方法

1.1对象

病例88例测试对象如表1，其中非糖尿病人19例，系参加年度体检全身无病的健康者，作为依照，47例PDR患者，因牵引性视网膜脱离施行玻切手术和/或清除玻璃体积血。所有糖尿病患者均已采用药物治疗，口服抗血糖或注射胰岛素，伴有高血压者同时用抗压药治疗。

表188例测试对象

1.2糖尿病鼠采用已成年（9-10w）雄性Sprague-Dawkey大鼠（体重250-300g），禁食一夜后，用美国Sigma公司出产的STZ（60mg/kg）溶于50mm枸橼酸钠缓冲液腹腔内注射，非糖尿病鼠仅注射等量缓冲液作对照。在注射后3d测体重和血糖浓度，从鼠的尾静脉抽血，血糖>250mg/dl确定为糖尿病鼠。

1.3检测方法

BDNF检测用酶联免疫吸附剂测试法（Enzyme-linkedImmunosorbentAssay，ELISA）。所有病例都于次晨空腹抽取静脉血3ml，离心（5000rpm）10min，4℃，吸取血浆储于-70℃待检。糖尿病鼠确定3w和10w后，腹腔内注射过量水合氯醛，施行断头术杀死，剥取视网膜，在冰冷缓冲液内冲洗，冷冻，于-70℃储存待用，对照鼠同样处置。在3w和10w后，对照/糖尿病鼠在分离视网膜后，从其心脏取血，冷储30min，离心，吸取血浆处于-70℃待检。检测视网膜内BDNF，需用超声波于溶化缓冲液内短期爆破，制成视网膜匀浆，离心10min，取其上清液做ELISA测试。

应用WesternBlotting法测试有/无糖尿病鼠视网膜内的BDNF蛋白水平。视网膜内的Caspase-3酶活性增强，应用Caspase-3色度计检测。

1.4统计学分析用SPSS12.0软件包行统计学分析，定量资料用x±s描述，糖尿病与对照组用配对t检验，P<0.05显示差异有统计学意义。

2结果

2.1BDNF值水平

应用ELISA技术检测非糖尿病人、DR和PDR患者的血清BDNF含量，各为25.5±8.5、21.8±4.9和10.0±8.1ng/ml，其中PDR患者与DR组和非糖尿病人比较，其血清BDNF有明显降低，差异具有统计学的意义（P<0.001）。

对实验动物糖尿病鼠，依其病程分为两组检测其血清BDNF含量，与同龄对照组鼠比较，3w糖尿病鼠的血清BDNF虽然较低，但差异尚不显著，至10w糖尿病鼠血清BDNF值为5.21ng/ml，较对照组鼠（7.16ng/ml）明显降低，具有统计学的意义（P<0.05）。至于糖尿病鼠视网膜中BDNF水平表达，应用Westernblotting测试技术，显示3w糖尿病鼠的表达水平降低43%，至10w糖尿病鼠降低至30%。此外，又用Westernblotting技术检测视网膜中原机凝蛋白（tropomyosin）有关的激酶受体TriB（为BDNF的一种特殊蛋白具有调节某些神经元的功能[6]），在3w和10w糖尿病鼠较同龄对照组鼠表达均明显降低（P<0.01）。而作为一种前酶存在于细胞内的Caspase-3活性测定，在3w糖尿病鼠视网膜中几乎较对照组鼠高出1倍，且直至10w糖尿病鼠仍然增高，差异极为显著（P<0.01）,它与BDNF表达水平作相关分析，显示负相关（r=-0.544，P=0.013）。

3讨论

DR是糖尿病微血管并发症中最重要的病变之一。由于糖代谢阻碍改变了毛细血管周细胞的生理功能，使毛细血管收缩力丧失，周细胞退行变性，基底膜增厚与内皮细胞增殖，视网膜毛细血管通透性增加和血液渗漏。现在认为DR不仅是一种毛细血管病变，且是神经血管性病变【1-5】。

本文重点研究了DR患者血清和STZ诱发糖尿病大鼠血清和视网膜中的BDNF水平降低，与既往学者报告的结果相似【7、8】。BDNF水平降低可引起糖尿病人脑神经退行性变性，阻碍胰岛素功能，在糖尿病动物试验中发现阻碍葡萄糖与脂质代谢，给予BDNF则代谢好转【7、8】。BDNF水平降低又知是脑神经病变疾病的致病因素，如阿尔茨默（alzheiners）病、孤独僻、痴呆、抑郁和精神分裂症等。作为神经元组织的视网膜，可产生神经营养因子，如神经生长因子（NGF）、BDNF和神经营养素3、4（NT-3、NT-4）。BDNF由视网膜中神经元和神经胶质细胞产生，可保护神经元细胞，其生物学功能与原机凝蛋白酶（TriB）受体有很高亲和力，缺乏BDNF或受体可引起视网膜功能严重改变。BDNF在视神经损伤后能减少视网膜神经节细胞损害，在啮齿动物氧化应激条件下可保护其神经元组织。最近Dai等发现BDNF的神经保护作用，是在低氧状态时Muller细胞增加谷氨酸盐摄取和谷氨酸合成酶的上调。有研究报告糖尿病人和糖尿病动物血清BDNF水平降低，引起葡萄糖和脂质代谢减少和增加食物的消耗，然而有关BDNF在DR中的作用仍未完全清楚。

Barber等曾研究经由作为神经元凋亡信号的半胱氨酸蛋白酶（Caspase）的激活途经，可引起糖尿病神经元凋亡。Sasaki等在糖尿病鼠实验中，为保护神经元，应用抗氧化剂能减少Caspase-3的激活和增加BDNF水平，另有报告眼内注射BDNF能保护神经元细胞并减少Caspase-3活性。Caspase-3活性增强在本组糖尿病鼠视网膜中表现十分明显，我们发现在BDNF水平与Caspase-3活性之间作相关测验，显示明显的负相关，提示在神经变性过程，经由Caspase激活途径可减少BDNF水平，而BDNF特殊受体（TriB）蛋白的表达，也显示BDNF水平降低。此外，BDNF水平降低可加剧突触后神经元谷氨酸盐中毒。由此可知BDNF水平降低，可在糖尿病早期损害视网膜神经元细胞，引起DR发生发展，同时也可推测，严重糖尿病人BDNF水平降低，可使早期视网膜神经病变进展至晚期PDR，因此在DR病变过程，调整BDNF水平，不论DR是血管新生（angiogenesis）或神经变性（neurodegeneration）都可能获得改善。

参考文献:

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[2]PengPH,LinHS.NervefiberlayerthininginpatientswithpreclinicalretinopathyCanJophthalmol,2009,44:417-422

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[7]FujinamiA,OhtaK,ObayashiH,etal.Serumbrainderivedneurotrophicfactorinpatientswithtype2diabetesmellitus.ClinBiochem,2008,41:812-817

[8]KrabbeKS,NielsenAR,Krogh-MadsenR.Brainderivedneurotrophicfactor(BDNF)andtype2diabetes.Diabtologia,2007,50:431-438

Δ通讯作者：杨宇光，E-mail:[e-mail]