红桂木凝集素的免疫调节作用初探

李璐刘小芹曾麒燕

李璐刘小芹曾麒燕（通讯作者）

（广西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室广西南宁530021）

【摘要】目的研究红桂木凝集素(ALL)对小鼠的免疫调节作用。方法首先，在无菌条件下提取Balb/c小鼠骨髓细胞，分离单个核细胞，以重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和白细胞介素4(rmIL-4)协同诱导下培养，培养至第六天，添加TNF-a或者ALL继续培养两天。CCK-8法检测细胞增殖；倒置显微镜观察细胞生长变化；ELISA法测培养上清中IL-12、IFN-γ的分泌水平。其次，小鼠皮内注射OVA和/或ALL；两周后断尾取血，酶联免疫夹心法(ELISA)检测小鼠血清中OVA特异性IgG的浓度。结果ALL能显著促进小鼠骨髓来源树突状细胞(BmDC)的增殖；并促进BmDC分泌细胞因子IL-12、IFN-γ；但不能增强OVA在小鼠体内产生特异性抗体的量。结论ALL在细胞免疫中具有很好的促进BmDC成熟及增殖的作用，但不能增强小鼠对OVA的特异性体液免疫应答。

【关键词】红桂木凝集素树突状细胞免疫调节

【中图分类号】R392【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）09-0074-02

红桂木为桑科桂木属（波罗蜜属）植物，产于广东、海南、广西等地，药用具有活血通络，清热开胃，收敛止血的功效[1]。我教研室周德义教授等通过对植物种子进行筛选，首次发现桂木种子含有丰富的能使兔、羊和豚鼠等动物的红细胞和人红细胞强烈凝集的凝集素,并做了较系统的基础研究[2]。红桂木凝集素(artocarpuslingnanensislectin)是一种性质稳定、凝集活性高的植物凝集素。本课题组前期研究发现ALL能有效抑制急性淋巴细胞白血病JurkatT细胞的生长[3]，且能有效促进人外周血单核细胞来源的树突状细胞的成熟及增殖[4]。树突状细胞是目前发现的体内最强的抗原提呈细胞，能激活初始T细胞，在诱导特异性免疫过程中起着重要作用[5]。树突状细胞与肿瘤的发生、发展有着密切关系。为了更好的研究ALL的免疫调节作用，在本实验中，以Balb/c小鼠为研究对象，用ALL刺激BmDC，观察ALL对BmDC生长的影响；并检测IL-12、IFN-γ水平；体内实验以卵清蛋白(ovalbumin,OVA)为抗原,对Balb/c小鼠皮内接种免疫，观察ALL能否增强OVA的免疫效果。

1材料与方法

1.1实验小鼠：Balb/c小鼠，雄性，4-6周龄，广西医科大学实验动物中心提供。

1.2试剂与仪器：红桂木种子，采自广西药用植物研究所；ALL由本实验室自行提取；RPMI-1640细胞培养液、胎牛血清（FCS）、青-链霉素双抗，购于美国Hyclone公司；重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF）、重组小鼠白细胞介素4（rmIL-4），购于美国PeprotechEC公司；细胞增殖检测试剂盒（cellcouningkit-8,CCK-8）,购于碧云天生物技术研究所；红细胞裂解液，购于solarbio公司；卵清蛋白（OVA），购于sigma公司；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG，购于北京中杉金桥生物技术有限公司；小鼠白细胞介素-12/P40(IL-12/P40)、γ干扰素（IFN-γ）ELISA定量测试剂盒，购于R＆D。

1.3实验方法

1.3.1BmDC的分离和培养：无菌条件下分离小鼠股骨和胫骨，用RPMI1640冲洗出骨髓细胞，吹打细胞悬液，4°C，1300rpm/min离心5min，弃去上清。加入3-5ml红细胞裂解液，置冰上3min，RPMI1640洗细胞两次，将细胞用含15ng/ml的rmGM-CSF、15ng/ml的rmIL-4、10%FCS和1%双抗的RPMI1640培养基（完全培养基）悬浮后，用(100×20mm)培养皿培养，置于37°C，5%CO2培养箱中，隔天半量换液。

1.3.2ALL对BmDC生长的影响：按照上述培养方法培养至第六天，将细胞悬液分至96孔细胞培养板中（每孔100ul，每组5个复孔）做如下分组：①ALL组:加入ALL使其终浓度分别为22.5ug/ml、90ug/ml、225ug/ml。②TNF-α组：加入TNF-α使其终浓度为50ng/ml。③对照组：加入等体积RPMI1640。培养48h后。倒置显微镜下观察各组细胞并于培养结束前3h加入CCK-8，每孔10ul，孵育3h后于酶标仪450nm处测吸光度值。计算增殖率。

1.3.3ALL对BmDC分泌IL-12、IFN-γ的影响：按照1.3.2方法培养，每组均设3个复孔，至第八天收集细胞上清液。ELISA法检测细胞培养上清液中IL-12、IFN-γ水平。

1.3.4小鼠皮内OVA免疫：将Balb/c小鼠随机分为3组，每组4只，分别为①OVA组：每只小鼠皮内注射10ugOVA；②OVA+ALL组：每只小鼠皮内注射10ugOVA+10ugALL；③PBS组：每只小鼠皮内注射同等体积的PBS。

1.3.5OVA抗体的检测：小鼠免疫两周后断尾取血，分离血清，ELISA法检测抗OVA的IgG。主要步骤如下：①包被：OVA包被浓度为1ug/ml，100ul/孔，4°C过夜。②封闭1h。③洗涤，并加入不同稀释度的血清，室温放置1.5h后洗板3次。④加入稀释的山羊抗小鼠HRP-IgG,室温放置1h后洗板三次。⑤加入TMB底物显色后加终止液，于450nm波长处检测OD值。

2结果

2.1ALL对BmDC生长的促进作用：倒置显微镜下观察细胞，各组细胞在15ng/ml的rmGM-CSF、15ng/ml的rmIL-4的作用下共培养八天。培养至第六天根据实验设计，加入不同浓度的ALL或TNF-α继续培养48h，第八天时，显微镜下可见较大体积的悬浮细胞，悬浮生长的BmDC大小不等，向四周伸展出大量毛刺状胞质突起，低倍镜下可观察到随着ALL浓度的增加，细胞集落呈现更多更大的细胞团；阴性对照组细胞生长缓慢，没有上述细胞形态。（见图1）图片放大倍数为10×10。

图1不同浓度红桂木凝集素（ALL）对BmDC生长的影响（第八天）

2.2不同浓度ALL对BmDC增殖率的影响：采用CCK-8法检测树突状细胞的增殖率，发现BmDC随着ALL浓度的增加，其增殖率呈上升趋势，如图2所示。90ug/ml与225ug/ml的ALL增殖率均高于作为阳性对照的TNF-a组。

图2CCK-8法检测ALL对BmDC生长的增殖作用曲线

2.3ALL促进BmDC分泌IL-12/P40、IFN-γ：ELISA法检测细胞培养上清液中IL-12、IFN-γ水平，结果如表1所示，ALL明显促进BmDC分泌IL-12/P40、IFN-γ。

表1红桂木凝集素（ALL）刺激BmDC细胞上清中分泌IL-12/P40、IFN-γ水平比较

注：与阴性对照组比较，*P<0.01

2.4ELISA法测定特异性OVA抗体：如图3所示，小鼠在免疫两周后，OVA组与OVA+ALL组血清中抗OVA特异性IgG浓度明显高于PBS组，但OVA组与OVA+ALL组比较，抗OVA特异性IgG浓度无明显差别。结果表明OVA能够刺激机体产生体液免疫，但ALL在小鼠体内并没有加强OVA的免疫效果。

图3小鼠抗OVA特异性抗体的效价检测

3讨论

凝集素是一种非免疫来源、对糖及其缀合物可逆专一识别的蛋白质分子，并能够促使细胞的凝集，广泛分布于植物、动物和微生物中；植物凝集素在细胞间的黏附、靶细胞的识别、机体的生长发育和肿瘤的浸润及转移中都有重要作用，尤其在免疫学上，能够促进淋巴细胞的有丝分裂，是一种重要的丝裂原[6]。

树突状细胞是免疫系统功能最强的专职抗原提呈细胞，能诱导和控制T、B淋巴细胞的活化，是调节特异性免疫应答的关键环节[7]。其主要功能是摄取、加工处理和提呈抗原，启动特异性免疫应答。树突细胞在机体免疫中无可替代的作用，使其成为肿瘤免疫治疗策略中越来越被关注的靶点。

树突状细胞也是体内重要的免疫调节细胞，可通过分泌不同的细胞因子参与固有免疫和适应性免疫应答，树突细胞可分泌以IL-12为主的细胞因子，其通过与Th细胞表面的IL-12受体结合，促进Th0向Th1分化，IL-12还可同时促进T细胞产生IFN-γ，而IFN-γ又反作用于树突细胞促进其产生IL-12，通过这种正反馈机制，增强细胞免疫应答。本实验结果表明ALL可以在体外促进BmDC分泌IL-12和IFN-γ。

特异性免疫应答由多种免疫细胞和免疫分子共同参与，是受MHC限制的极其复杂的过程。鸡卵清蛋白OVA在免疫研究中作为模拟肿瘤抗原而应用，OVA中MHC-I特异的序列SINFEKL具有强免疫原性。本研究证实了ALL在体外能促进BmDC的增殖和成熟，刺激IL-12和IFN-γ的分泌，为了进一步研究ALL在体内的免疫调控作用，通过小鼠皮内免疫OVA发现ALL并不能增强OVA的免疫效果。因此，ALL可能主要是参与细胞免疫调控，其机制有待进一步研究。

参考文献

[1]中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京科学出版社，1986：53.

[2]关祺芳，赵刚，周德义.白桂木凝集素、红桂木凝集素和Jacalin对人外周血中淋巴细胞激活的研究[J].广西医科大学学报，1994，11(3):263-264.

[3]崔博，曾麒燕.红桂木凝集素对JurkatT淋巴细胞生长的影响[J].广西医学，2011，33(4):410-413.

[4]王婧娉，李璐，曾麒燕.红桂木凝集素对树突状细胞生长的影响[J].广西医学，2012，34(6):670-672.

[5]SteinmanRM，CohnZA.IdentificationofanovelcelltypeinperipherallymphoidorgansofmiceII.Functionalpropertiesinvitro[J].JEM,1974,139(2):380-397.

[6]DustinML，ChanAC.Signalingtakesshapeintheimmunesystem[J].Cell，2000，103(2):283-294.

[7]AarntzenE.H，FigdorC.G，AdemaG，etal.Dendriticcellvaccinationandimmunemonitoring[J].CaneerImmunolImmunother，2008，57:1559-1568.

基金项目：国家自然科学基金（81160366）；广西自然科学基金（0832130）