HCG联合免疫球蛋白对滋养细胞HLA-G表达的影响

宗威威刘福民

宗威威刘福民

（江苏省徐州市徐州医学院江苏徐州221004）

【摘要】目的：探讨hCG联合免疫球蛋白对滋养细胞HLA-G表达的影响。方法：选用表达HLA-G的绒癌细胞系JEG-3，应用hCG、免疫球蛋白、hCG+免疫球蛋白分别处理JEG-3细胞48h，用RT-PCR方法检测HLA-G的mRNA水平，Western-blot方法检测HLA-G的蛋白水平。结果：hCG和免疫球蛋白均可显著上调HLA-G的mRNA及蛋白的表达，以hCG+免疫球蛋白组上调作用最明显。结论：HCG和免疫球蛋白可通过上调HLA-G的表达参与母胎免疫耐受。

【关键词】hCG；免疫球蛋白；HLA-G；JEG-3；母胎免疫耐受

【中图分类号】R-33【文献标识码】A【文章编号】1004-6194（2015）01-0117-02

【Abstract】Objective：TostudytheeffectofhCGandimmunoglobulinontrophoblastcellHLA-G.Methods：TheHLA-Gpositivecelllineofchoriocarcinoma(JEG-3)wasdifferenttreatedwithhCG、immunoglobuli、hCGandimmunoglobulifor48hours,themRNAexpressionofHLA-Gwasdetectedbyreal-timeRT-PCR,andproteinlevelbyWesternblot.Results：HCGandimmunoglobulinmayup-regulateHLA-Gexpression.Theup-regulateofhCGandimmunoglobulingroupsismostobvious.Conclusion：HCGandimmunoglobulincanparticipateinmaternalfetalimmunetolerancebyupregulatingtheexpressionofHLA-G.

【Keywords】hCG;immunoglobulin;HLA-G;JEG-3;maternalfetalimmunetolerance

HLA-G属非经典HLA-I类基因，最早由Geraghty等克隆并测序，位于第6号染色体HLA-A端粒侧[1]，其基因结构与HIA-A、HLA-B和HLA-C相似。HLA-G分子主要在人胎盘组织中转录，高表达于母胎界面绒毛膜外滋养细胞，而在胎盘绒毛的合体滋养层中表达水平较低。Blaschitz[2]等报道，HLA-G限制性地主要表达在绒毛膜外细胞滋养层，具有特殊的组织选择性分布和较低的多态性，目前已广泛被认为是一种免疫耐受分子。HLA-G通过抑制妊娠期子宫蜕膜内自然杀伤细胞（dNK）和细胞毒性T细胞（CTL）等的细胞毒作用，调节细胞因子释放的平衡，提高胚胎的卵裂速率等机制，诱导母胎界面的免疫耐受，保护胎儿正常发育，在母胎免疫耐受和胚胎分裂、着床等方面发挥着重要作用[3]。是维持正常妊娠的重要因素。研究表明[4],hCG及免疫球蛋白的免疫调节作用均在成功妊娠中发挥重要作用，它们是否参与了调节HLA-G的表达，目前尚不清楚。我们选择表达HLA-G的JEG-3细胞作为研究材料，JEG-3细胞可高度表达HLA-G,而不表达HLA-II类抗原和HLA-Ia抗原,是研究绒毛外滋养细胞的适宜体外模型，我们应用hCG、免疫球蛋白作用于JEG-3细胞，观察二者对HLA-G的表达的影响，探讨其在母胎免疫耐受中的作用机制。

1材料与方法

1.1细胞株绒毛膜癌细胞JEG-3，购自中国科学院细胞库。

1.2主要试剂

高纯总RNA快速提取试剂盒购自上海捷瑞；逆转录试剂盒购自天根生化科技有限公司；聚合酶链反应试剂盒为2×TaqMasterMix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成,用于Western杂交的HLA-G的一抗为鼠抗人HLA-G单克隆抗体（MEM-G9），购自Secrete公司，二抗为DAKO公司的兔子抗鼠辣根过氧化酶（HRP-）标记的抗体（P0447）。

1.3细胞培养及分组

JEG-3细胞培养于DMEM/F12培养液中，含有10%胎牛血清及抗菌素。将1×104JEG-3细胞种植于6孔板中，种植24h后观察细胞生长情况，当细胞40％融合后加入hCG和免疫球蛋白。实验分组：①JEG-3空白对照组②hCG培养组③免疫球蛋白培养组④hCG+免疫球蛋白培养组，每孔培养液为5ml,HCG的浓度为5IU/ml,人免疫球蛋白的浓度为1mg/ml。

1.4RT-PCR检测HLA-GmRNA的表达药物作用于JEG-3细胞48h，收集细胞提取总RNA逆转录合成cDNA，取cDNA2μl，上下游引物各1μl，2×Mix12.5μl，无核酶水8.5μl，组成25μl反应体系。HLA-G引物：上游：5'-GATGGAGTAAGGAGGGAGATGGAGG-3'，下游：5'-CCTTCCTTACCTGAGCTCTTCTTTC-3'（产物254bp）；β-actin引物：上游：5'-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3'，下游：5'-CGGACTCGTCATACTCCTGCTTG-3'（产物481bp）。PCR程序为：95℃预变性5min,95℃30s，55℃退火45s（β-actin为64℃），72℃1min，共35个循环，72℃10min。扩增所得PCR产物的特异性经溶解曲线分析和2.0％琼脂凝胶电泳证实。

1.5Western-blot方法检测HLA-G蛋白的表达应用常规蛋白提纯方法，JEG-3细胞经细胞裂解液裂解、离心并收集上清后行蛋白定量。20μg的蛋白用于Western杂交。分别比较不同加药组HLA-G的蛋白表达。应用ECL检测系统测定蛋白表达。同一张膜经洗膜后重新与β-actin作用作为参照。

1.6统计学处理：用SPSS16.0软件分析，分组资料以均数+标准差表示，进行单因素方差分析，Dunnett’ST3法进行两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1hCG联合免疫球蛋白对HLA-GmRNA的影响

RT-PCR结果显示，HCG和免疫球蛋白作用48h后，HLA-GmRNA明显升高，且以hCG+免疫球蛋白组HLA-GmRNA表达最强（P<0.05）,差异有统计学意义。见图1，表1。

3讨论

妊娠是一个复杂的生理过程，带有父方抗原的胎儿及其附属物类似半异体移植物，将引致母体免疫系统对其进行免疫识别及应答，一旦母胎免疫失衡，将发生流产、妊高症、IUGR等病理性妊娠。目前HLA-G在母胎免疫中的重要性引起了广泛重视。HLA-G是I类人类组织相容性抗原，最早被发现表达于母胎界面的绒毛外细胞滋养层细胞，抑制多种免疫细胞的功能，具有免疫调节的功能，研究表明在绒毛外滋养细胞、细胞滋养层细胞、合体滋养层以及绒毛基底层的增殖性细胞滋养层等细胞中均能检测到HLA-G的表达，但其主要表达于胎盘组织母胎界面的绒毛外滋养细胞层细胞,调节胎盘组织母胎界面的免疫调节。

在研究滋养细胞功能的实验中，由于获得和培养胎盘原代滋养细胞比较困难，并且在分离和短期应用中，细胞功能可发生一些潜在的变化，因此原代滋养细胞在实验中的应用受到限制。故本实验选用表达HLA-G的人绒癌滋养细胞系JEG一3细胞进行培养，JEG-3细胞可高度表达HLA-G、-E,而不表达HLA-II类抗原和HLA-Ia抗原，是研究绒毛外滋养细胞的适宜体外模型。

我们的研究结果显示hCG及免疫球蛋白均可作用于绒毛膜癌细胞JEG-3，上调HLA-G的mRNA及蛋白的表达，其中以hCG联合免疫球蛋白组上调作用最明显，差异有显著性。hCG在正常妊娠滋养细胞中的表达可以贯穿整个孕期，但在早、中孕期为高水平，hCG还能抑制淋巴细胞的免疫性，以激素屏障保护滋养层不受母体的免疫攻击，是维护胎儿的关键[5-6]。Zygmunt等在一项滋养细胞浸润实验中发现，hCG水平越高，绒癌细胞系JEG-3细胞浸润越显著，而细胞的增殖并未受到影响[7]。因此我们认为hCG可能通过滋养细胞HLA-G的表达，增加滋养细胞的浸润能力，有利于早期妊娠的稳定进展。免疫球蛋白具有辅助的免疫调节作用，其与特异性抗原结合，参与特异性免疫应答，免疫球蛋白的Fc段与NK细胞表面抗原CD16结合，可部分阻滞、抑制NK细胞的毒性效应，降低NK细胞的杀伤性[8]。在我们的研究结果中，hCG联合免疫球蛋白组对HLA-G的上调作用最为明显，因此我们推测hCG与免疫球蛋白具有协同作用，通过上调HLA-G的表达，抑制母胎界面自然杀伤细胞的毒性，调节Th1/Th2的免疫平衡等方式共同维持母胎免疫耐受，维持胚胎植入和早期妊娠，也可能是其防止早期自然流产发生的机制之一。

参考文献：

[1]KollerBH,GeraghtyDE,DeMarsR,etal.ChromosomalorganizationofthehumanmajorhistocompatibilitycomplexclassIgenefamily.JExpMed,1989,169:469-480

[2]BlaschitzA,JuchH,VolzA，eta1．ThesolublepoolofHLA-Gproducedbyhumantrophoblastdoesnotincludedetectablelevelsoftheintron4-containingHLA-G5andHLA-G6isoforms[J]．MolHumReprod，2005,l1(10)：699-710．

[3]RizzoR,VercammenM,vandeveldeh,etal.TheimportangceofHLA-Gexpressioninembryos,trophoblastcells,andembryonicstemcells[J].CellMolLifeSci,2011,68:341-352

[4]沙静，刘福民，王文，等.免疫球蛋白联合绒毛膜促性腺激素对原因不明复发性流产患者外周血Th17/Treg平衡的影响［J/CD］.中华临床医师杂志：电子版，2014，8（1）：75-79.

[5]BambergerAM,JenatschkeS,SchulteK,etal.Leukemiainhibitoryfactory(LIF)stimulatesthehumanHLA-GpromoterinJEG-3choriocarcinomacells.JClinEndocrinolMetab,2000,85:3932-3936

[6]金海岚.孕早期绒毛膜促性腺激素治疗不明原因复发性流产[J].现代实用医学，2009,21（6）：635-63

[7]ZygmuntM,HahnD,MunstedtK,etal.InvisionofcytotrophoblasticJEG-3cellsisstimulatedbyhCGinvitro.Placenta,1998,19:587-593

[8]陈映婷，郭晴虹丙种球蛋白联合低分子肝素治疗不明原因复发性流产的临床观察[J].中国当代医药，2014,21（3）：51-52.