五味子乙素对肝癌细胞抑制作用的初步研究

黎鹏1李淑贤1邓子亮1郭洪胜1王森1何素辉2(通讯

黎鹏1李淑贤1邓子亮1郭洪胜1王森1何素辉2(通讯作者)

(1广东医科大学基础医学院组胚教研室广东东莞523808)

(2广东医科大学第二临床学院广东东莞523808)

【摘要】目的：探讨五味子乙素对肝细胞癌细胞增殖的影响。方法：肝癌细胞系HepG2和MHCC97H细胞。将本实验室保存的两种细胞分别分为对照组和实验组，经过五味子乙素(50μmol/L、100μmol/L)加药处理后,观察细胞形态变化并利用CCK-8试剂盒在24h,48h,72h进行细胞增殖实验检测。结果：与对照组相比，50μmol/L浓度下，在24h、48h、72h，HepG2细胞被分别抑制了约19.62%,19.05%,11.33%，两组差异显著(P＜0.05)。在100μmol/L浓度下24h、48h、72h抑制率分别为4.35%,11.67%,16.03%两组差异显著（P＜0.05)。MHCC97H细胞的抑制率约为4.43%,9.66%,26.84%，仅72h数据差别有统计学意义差异显著(P＜0.05)在100μmol/L浓度下24h、48h、72h抑制率分别为24.38%,33.56%,52.36%，差异显著(P＜0.05)。与对照组比较，经过五味子乙素处理细胞体积缩小，数量减少。结论：五味子乙素抑制HepG2和MHCC97H细胞的细胞增殖能力。

【关键词】肝细胞癌，五味子乙素，增殖

【中图分类号】R246.5【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2019）06-0021-02

PreliminarystudyontheeffectofSchisandrinontheproliferationofhepatocellularcarcinomacells

LiPeng1,LiShuxian1,DengZiliang1,GuoHongsheng1,WangSen1,HeSuhui2(correspondentauthor).

1DepartmentofEmbryoTeachingandResearch,CollegeofBasicMedicalSciences,GuangdongMedicalUniversity,DongguanGuangdong523808,China;

2No.2ClinicalCollegeofGuangdongMedicalUniversity,Dongguan,Guangdong523808,China

【Abstract】ObjectiveTodiscusstheinfluenceofSchisandrinBoncellproliferationofhepatocellularcarcinoma.MethodsHepG2andMHCC97Hcellswerepidedintocontrolgroupandexperimentgroup,andthenweretreatedwithSchB(50μmol/L、100μmol/L).CCK-8wasusedforproliferationdetectionat24h,48h,72h.ResultsComparedtothecontrolgroup,theinhibitionratesonHepG2cellswere19.62%,19.05%,11.33%（50μmol/L,P<0.05）and4.35%,11.67%,16.03%(100μmol/L,P<0.05).TheinhibitionratesonMHCC97Hcellswere4.43%,9.66%,26.84%（50μmol/L,P<0.05onlyfor72h）and24.38%,33.56%,52.36%(100μmol/L,P<0.05).CellstreatedwithSchBbecamesmallerandthenumberwasalsodecreased.ConclusionSchBcouldinhibitproliferationofHepG2andMHCC97Hcells.

【Keywords】Hepatocellularcarcinoma,SchB,Proliferation

肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是我国高发病率的恶性肿瘤，严重危害人们生命健康。目前植物来源的药物已被广泛应用于肿瘤的预防与治疗，其中五味子乙素（schisandrinB,SchB）就是一种备受关注的抑制肿瘤增殖的中药。研究发现，SchB具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等多种药理作用[1-2]，可以抑制多种癌症如乳腺癌、肺癌和胆管癌等[3-5]肿瘤细胞的增殖和迁移。SchB对HCC作用的报道比较少。因此，本课题组初步探讨了SchB对HCC细胞体外增殖的影响，为进一步进行HCC的药物治疗提供实验基础和潜在的药物分子。

1.材料和方法

2.1材料

人HepG2细胞和MHCC97H细胞为本实验室保存。胎牛血清、细胞培养基（DMEM）购买自Gbico公司。胰蛋白酶-EDTA消化液购自Lifetechnologies公司；双抗(青霉素、链霉素)购自碧云天生物工程有限公司；五味子乙素和DMSO购自北京索莱宝科技有限公司；细胞增殖检测用CCK-8试剂盒由购自Dojindo。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养及分组HepG2和MHCC97H细胞用DMEM培养基，置于37℃、含有5%CO2的恒温细胞培养箱中培养。给药前24h取对数生长期的HepG2和MHCC97H细胞，经0.25％胰酶消化后显微镜下进行细胞计数，按每孔3×105个细胞的数量，以每孔2mL细胞悬液铺于6孔板。实验分对照组和SchB实验组（低剂量50μmol/L和高剂量100μmol/L）。

1.2.2药物制备及给药将1mLDMSO加入20mgSchB粉剂中充分溶解，制成浓度为0.05mol/L的SchB工作液。HepG2和MHCC97H细胞于6孔板培养24h后,对照组分别加入EMSO试剂2μL和4μL，五味子乙素实验组分别加入2μL（终浓度50μmol/L）和4μL（终浓度100μmol/L）的SchB工作液。继续培养。

1.2.3CCK-8实验以每孔5×103细胞的数量，100μL细胞悬液铺板于96孔板中，每组细胞5个复孔，给药后24h、48h、72h时分别加入CCK8每孔10μL,1～2h后酶标仪检测450nm吸光度值并计算细胞增殖抑制率。

1.3统计学分析

数据采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析，计数资料采用率（%）表示，进行χ2检验，计量资料采用（x-±s）表示，进行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1SchB处理的肝癌HepG2和MHCC97H细胞增殖能力下降

CCK8试验结果显示，加药处理24h、48h、72h后，SchB组肝癌细胞的增殖与对照组相比，HepG两组在SchB50μmol/L剂量，于24h、48h、72h分别抑制了约19.62%,19.05%,11.33%，24h～72h差别均有统计学意义(P＜0.05)；在SchB100μmol/L剂量，于24h、48h、72h分别抑制了约4.35%,11.67%,16.03%，d2～72h差别均有统计学意义(P＜0.05)。MHCC97H组在SchB50μmol/L剂量，24h、48h、72h分别抑制了约4.43%,9.66%,26.84%，仅有72h差别有统计学意义(P＜0.05)；在SchB100μmol/L剂量，于24h、48h、72h分别抑制了约24.38%,33.56%,52.36%，24h～72h差别均有统计学意义(P＜0.05)，见图1A、B。本结果提示SchB可抑制肝癌HepG2和MHCC97H细胞体外增殖能力。

另外，对比同样浓度SchB对两种细胞增殖影响的差异，在50μmol/L给药处理的结果中，SchB对两种肝癌细胞株的增殖影响的差异在24h和72h有统计学意义（P＜0.05），48h则无差别；而在100μmol/L浓度，SchB对两种肝癌细胞株的增殖影响的差异在24h～72h均有统计学意义（P＜0.05）。见图1C、D。

2.2SchB对肝癌HepG2和MHCC97H细胞形态的影响

SCHB组HepG2细胞和MHCC97H在加药处理培养24h、48h和72h后，和对照组相比较，细胞数量均有所减少，细胞变小，死亡细胞增多。以HepG2细胞在50μmol/L的SCHB加药处理，以及MHCC97H细胞100μmol/L的SCHB加药处理后，细胞增殖抑制尤为明显，如图E-P所示。

图SchB加药处理的HepG2和MHCC97H细胞增殖（%）和细胞形态(×200)

（A、B，SchB给药处理HepG2和MHCC97H细胞后细胞增殖能力；C、D，对比同一浓度SchB对两种细胞增殖影响的差异，C，50μmol/L；D，100μmol/L；E、F、G，HepG2细胞对照组24h.48h.72h；H、I、J，HepG2细胞SchB50μmol/L组；K、L、M，MHCC97H细胞对照组24h.48h.72h；N、O、P，MHCC97H细胞SchB100μmol/L组。）

3.讨论

五味子乙素（schisandrin,SchB）是从中药五味子中提取出来的活性物质，分子量是400.46，属木脂素类，是五味子的主要活性成分之一[6]，近年来研究发现它具有抗肿瘤作用，诱导肿瘤细胞分化及凋亡、逆转肿瘤细胞多耐药性、增加其他抗肿瘤药物的敏感性、抑制肿瘤血管生成等机制来抑制肿瘤的生长及转移[7-8]。研究发现SchB能够促进阿霉素在人肝癌细胞系(SMMC7721细胞)诱导的凋亡[7]。本研究为SchB对HCC细胞抗肿瘤作用的补充，进一步在两株人肝细胞癌HepG2细胞和MHCC97H细胞中探讨其对增殖的影响。

本实验CCK-8结果发现，SchB组肝癌细胞的增殖与对照组相比，两种剂量的HepG2细胞组和HCC97H细胞组都有增殖抑制。另外，对比同样浓度SchB对两种细胞增殖影响的差异，并且在50μmol/LSchB作用下，肝癌HepG2细胞受到增殖抑制比MHCC97H细胞的早；而在100μmol/L浓度，SchB对两种肝癌细胞株的增殖影响的差异均有统计学意义，说明SchB作用于肝癌MHCC97H细胞发挥的增殖抑制比HepG2细胞的出现得早及明显。镜下观察肝癌细胞形态和数量，发现SchB组细胞在加药处理后，细胞数量均有所减少，细胞变小，死亡细胞增多，从形态学上进一步证实SchB确实可以抑制肝癌细胞的体外增殖能力，尤其是对MHCC97H细胞。综上，本研究发现，SchB能有效地抑制HepG2细胞和MHCC97H细胞的细胞增殖能力，为将来进一步深入研究分子机制打下基础，也为肝癌防治提供潜在的新型药物分子。

【参考文献】

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本研究由广东省科技计划项目（2016A020215147,2018A030307026）,广东省卫生厅医学科研基金（A2017605，A2018380，A2018548）及东莞市科技计划社会发展项目（20185071521341）资助。