酶联法检测丙型肝炎病毒抗体假阳性的原因分析

曹立香

曹立香

（黑龙江省双鸭山市疾病预防控制中心黑龙江双鸭山155100）

【关键词】酶联免疫吸附法；丙型肝炎病毒抗体；假阳性

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）26-0104-02

丙型肝炎（HepatitisC，简称丙肝）是有丙型肝炎病毒（HCV）引起的危害广大人群肝脏健康的一种传染性疾病，目前临床上把检测患者血清丙肝抗体（HCV-Ab）做为诊断丙肝的主要依据，酶联免疫吸附法（ELISA）因其灵敏度高、特异性强，是进行HCV-Ab的主要检测方法之一[1]，但实验室在检测丙肝抗体，有许多因素影响ELISA测定，可能会导致假阳性的结果。现对2013年5月～2014年9月检测的抗HCV抗体结果中32份弱阳性标本进行如下分析。

1材料与方法

1.1标本来源2007年5月～2009年9月我院门诊和住院患者检测HCV抗体的标本。

1.2仪器与试剂仪器：DA-7600核酸扩增实时荧光基因分析仪为达安基因股份有限公司产品；BIONADMODEL1575自动洗板机；普朗DNM-9602酶标仪。试剂：HCV-RNA测定试剂为达安基因股份有限公司产品；HCV抗体酶联免疫试剂由北京万泰生物药业有限公司提供。

1.3方法采患者清晨空腹静脉血3-5mL,将其离心分离血清,先用ELISA法检测HCV-Ab(1-2h内)3次,对3次结果均为弱阳性的标本,用核酸扩增荧光基因分析法检测其HCV-RNA。

1.2.3质控所有试剂均在有效期内，全部仪器、设备运行状况良好，每日质控结果、每批测定阴阳对照均在可信范围，HCV-Ab参加黑龙江及卫生部临检中心质控成绩均为合格。

2结果

32例酶联免疫吸附法HCV抗体阳性的标本再用核酸扩增荧光基因分析法检测HCV-RNA，有24例为阳性（占75％），其中假阳性的有8例（占25％）。

3原因分析

3.1疾病和其他因素干扰①类风湿因子(RF)的干扰，RF可大量存在于类风湿性关节炎及某些患有自身免疫性疾病患者的体内，RF多为IgG，它有与变性IgG产生非特异结合的特点。因此在抗HCV测定中，如血清标本中存在RF，则其可以与固相上的IgG和酶标的IgG结合,而出现假阳性反应。②高免疫球蛋白血症，抗HCV的间接法最后一步加的是酶标的抗人IgG,血清中的高浓度的非特异IgG可能会致非特异地吸附于固相表面,从而与后加的酶标抗人IgG结合,造成假阳性。③标本中SOD的干扰。用于包被固相的重组HCV抗原片段C100如为酵母菌产生的SOD融合蛋白,则标本中的SOD升高可能会造成抗HCV假阳性结果。④用于固相包被的HCV基因工程抗原不纯。

3.2标本的处理标本分离不好即进行加样，血清与纤维蛋白原分离不完全，使纤维蛋白原吸附于孔壁，难以清洗彻底；标本重度溶血；相邻的标本出现阳性污染。

3.3加样加样时间过长造成加样后放入恒温箱前等待时间过长；标本加完后加酶试剂时溅出孔外；加样后孔壁上贴有微小血块。

3.4温育温育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发吸附于孔壁，难以彻底清洗；温育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。

3.5洗板（1）手工洗板时，孔与孔之间液体交叉。（2）自动洗板机洗板时，洗板针堵塞，抽吸不完全；洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板次数少。

3.6解决方法（1）标本若为凝固血，最好将标本先自然存放1h，再用3000r/min离心15min；（2）加样后加贴封片及时放入恒温箱。（3）加酶试剂时不要滴出孔外，如有用吸水纸轻拭吸干。（4）严格按说明步骤控制操作时间。但适当延长反应时间，可提高阳性标本特别是弱阳性的检出率，对阴性标本无明显影响。（5）保证洗板针畅通，洗液注满各孔，洗完后在吸水纸上轻拍吸干。（6）显色剂不要混用；不要用过期的显色剂；加显色剂时不外流。（7）每天应做质控、阳性对照、阴性对照。（8）考虑到各种疾病的干扰。

4讨论

目前，确定和临床广泛应用的HCV感染诊断方法有两大类：检测患者血清HCV-Ab和HCV-RNA，虽然最近也发展了丙肝抗原（HCV-Ag）检测技术，但尚未得到广泛应用。对血清（或血浆）HCV-RNA的检测是目前唯一直接揭示存在的使用方法，但PCR也存在着技术复杂，要求特殊设备、费用高等缺点，难以在基层医院推广应用。我国丙型肝炎感染率仅次于乙肝,急性丙型肝炎大部分会转变成慢性丙型肝炎,丙型肝炎的自然转阴率很低,现阶段而言,丙型肝炎治疗效果也很不好。目前临床诊断丙型肝炎的常用指标是HC-VAb。临床检测患者血清HC-vAb主要有胶体金试纸法(GCIA)和酶联免疫吸附(ELsIA)方法,GclA法虽然操作简捷、反应快速,但是灵敏度低、重复性差,仅仅在初步筛查时可使用[2]。而ELISA法具有较高灵敏度、特异性强、可进行定量和半定量测定等优点成为检测HCV感染的主要方法。

影响酶联免疫实验的因素较多，诸如标本的采集保存、试剂的准备、加样的技术、孵育温度的控制、显色反应时间的控制、洗涤反应板的方式等发生的一系列问题均有可能对试验结果产生很大的影响，只有避免了这些因素，才能保证试验结果的准确性和可靠性。此外，虽然第三代ELISA试剂比第一、二代试剂有明显的改进，但对于强阳性或弱阳性样本的检测，国产试剂的S/CO值高于进口试剂,其特异性也明显低于进口试剂，在筛查特异性方面,丙肝抗体酶联免疫检测试剂的特异性不如想象的高,以至于出现更多的假阳性结果；再加之抗HCV酶免检测试剂皆没有灰区的设定，S/CO比值较低的结果也报告阳性，也是假阳性比较多存在的原因。因此有条件的单位应为丙肝抗体阳性的患者进一步做HCVRNA和RIBA补充实验，以排除假阳性。

参考文献

[1]刘学文.丙肝抗体假阳性检测中ELISA法应用[J].中国药物经济学，2012，(4)：191-192.

[2]伊新奎.ELISA法检测丙型肝炎抗体的假阳性原因分析[J].中国医药指南，2013，11(36)：383.