HPLC法测定盐酸安他唑啉的血药浓度及其药动学研究

石迎迎1陈辞2

石迎迎1陈辞2

1.郑州人民医院药学部河南郑州450000；2.河南省人民医院药学部河南郑州450003

摘要：目的建立一种简便、选择性强的HPLC法，用来测定Beagle犬血浆中盐酸安他唑啉的浓度，并研究其在Beagle犬内的药动学行为。方法采用液-液萃取法提取血浆中的药物，用HPLC法来测定血浆中盐酸安他唑啉的含量。结果盐酸安他唑啉在20.0~1600ng?ml-1的线性关系良好（R>0.99），最低定量限20.0ng?ml-1，提取回收率高于80%，日内、日间RSD值均在15%范围内。Beagle犬静脉注射给药后得出了主要动力学参数T1/2，AUC0–t，AUC0–∞，CL。结论本文首次建立了Beagle犬血浆中盐酸安他唑啉的HPLC法。该法快速、准确、灵敏，并成功用于盐酸安他唑啉在Beagle犬体内的药动学研究。

关键词：盐酸安他唑啉；HPLC；药代动力学；Beagle犬

Abstract：AimInordertoestablishasimpleandgoodselectivityoftheHPLCanalysismethodfordeterminetheconcentrationofAntazolinehydrochlorideinBeagledogplasmaandtostudythepharmacokineticcharactersinBeagledogs.MethodsPlasmasampleswereprocessedbyliquid-liquidextractionandtheHPLCanalysismethodwasdevelopedtodeterminetheconcentrationofAntazolinehydrochlorideinBeagledogplasma.ResultsStandardcalibrationgraphforAntazolinehydrochloridewaslinearwithinarangeof20-1600ng?mL-1（R>0.99）andthelowerlimitofquantificationwas20ng?mL-1.Theextractionrecoveriesweregreaterthan80%，theintra-andinter-dayprecisionvalueswerelessthan15%relativestandarddeviation（R.S.D）.Afterintravenousinjection，themainpharmacokineticparametersofT1/2，AUC0–t，AUC0–∞，CLwerefinallygot.ConclusionTheRP-HPLCmethodwasestablishedfirstinordertodetermineAntazolinehydrochlorideinBeagledogplasma.Themethodissensitive，specific，quickandeasyfordeterminationofAntazolinehydrochlorideinBeagledogplasmaandtostudythepharmacokinetics.

Keywords：Antazolinehydrochloride；RP-HPLC；Beagledog；Pharmacokinetics

盐酸安他唑啉原本为乙二胺类抗组胺药，临床应用于心律失常的治疗[1，2]，为一老药新用的Ia类抗心律失常药物[3，4]。临床研究发现，其对于洋地黄导致的室性心动过速与异位搏动以及实验性的阵发性室性心动过速具有显著的预防和治疗效果[5]。对于不能耐受奎尼丁以及其他抗心律失常药物的患者，其在治疗室性早搏、房性早搏以及室性心动过速等方面更加适用[6-7]。

1材料与方法

1.1药品与试剂

盐酸安他唑啉对照品（批号：20121023，含量：99.8%，上海玉瑞生物科技有限公司安阳分公司）；内标非那西丁（批号：0095-8904，纯度：99.99%，中国药品生物制品鉴定所）。

甲醇为色谱纯，购自美国Fisher公司；其它试剂均为分析纯，均购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2试验动物与样品采集

健康成年Beagle犬6只，雌雄各半，体重10.5-12.5kg，北京市实验动物中心提供[动物合格证号：SCXK（京）2009—0001]。实验前驯养观察两周，确保健康环境适应。

Beagle犬于给药前禁食12h，自由饮水，前肢隐静脉采集空白血。以4.5mg?kg-1的剂量于一侧前肢隐静脉注射给药（给药体积约10mL），于给药后0.083，0.17，0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，10h在静脉注射前肢的另一侧前肢隐静脉依次采血大约1.5mL。立即置于肝素化离心管中，5000rpm离心5min，取血浆500μL，储存在-20°C冰箱内。

1.3色谱条件

色谱柱为：ZorbaxEclipseXDBC18柱（5μm，150×4.6mmi.d.；AgilentTech，USA）；流动相为：甲醇-5mmol?L-1四丁基溴化铵（45：55，v/v）流动相中含0.5%冰乙酸；流速为1.0mL/min；柱温30℃；检测波长241nm。

1.4血浆样品预处理

取500μL血浆，加入50?lNaOH（0.1mol?L-1），涡旋混匀30s，加入10μL内标，涡旋混匀30s，加入乙酸乙酯1mL，涡旋混匀3min，13000rpm离心10min，取上清液800μL真空浓缩仪40℃浓缩至挥干，残渣用100μL甲醇/水（1：1，v/v）复溶，注入20μL进样分析。

2分析方法的验证

2.1专属性

本试验条件下，盐酸安他唑啉和内标物的保留时间分别为4.11min和6.10min，并且血浆内源性物质对测定无明显干扰。

2.2标准曲线和定量下限

制备血浆样品，使盐酸安他唑啉的浓度分别为20，50，100，200，400，800，1600ng?mL-1。依照“血浆样品预处理”项下操作，以待测物的浓度为横坐标，以样品峰面积与内标峰面积比为纵坐标，用加权（W=1/C2）最小二乘法进行回归运算[8]，得到标准曲线方程y=0.002x+0.2648（r2=0.9995），方法确证典型标准曲线见图1。由此可知，线性范围为20～1600ng?mL-1，定量下限为20ng?mL-1。

Fig1StandardcurveofantazolinehydrochlorideinBeagledogplasmadeterminedbyHPLCmethod

2.3精密度与准确度

依照标准曲线的制备方法，制备低、中、高3个浓度（50，200，1200ng?mL-1）的血浆样本各6份，按“血浆样品预处理”项下操作，进样20uL，连续测定3天。根据当日随行标曲计算样品的测定浓度进行方差分析，计算日内和日间相对标准偏差，实验数据表明质控样品（QC）的精密度小于14.3％；准确度在85％～115％之间，分析方法符合FDA有关规范的要求[9]。

2.4提取回收率

依照标准曲线的制备方法，制备低、中、高3个浓度（50，200，1200ng?mL-1）的血浆样本各6份，按“血浆样品预处理”项下操作，进样20uL。配制相应浓度的盐酸安他唑啉标准溶液，同时进样分析。以测得的血浆样品峰面积与标准溶液中盐酸安他唑啉的峰面积作比值，算得3个浓度的提取回收率分别是88.3%，89.9%和87.0%，由此可见提取回收率符合生物样品分析要求。

2.5稳定性

依照标准曲线的制备方法，制备低、中、高3个浓度（50，200，1200ng?mL-1）的血浆样本各6份，按“血浆样品预处理”项下操作，进样20uL。将测定结果代入当日随行标曲算出测定浓度，结果表明实测值与加入量基本一致，说明盐酸安他唑啉在各条件下放置均稳定。本实验分别进行了室温（放置2h）、处理后（室温放置24h）、长期冻存（-20°C，1month）以及三次冻融（-20°C）稳定性试验。

3药代动力学研究

6只Beagle犬单剂量静脉注射4.5mg?kg-1盐酸安他唑啉后，按“血浆样品预处理”项下操作，按法测定。采用非房室模型法计算各药动学参数见表1及血药浓度-时间曲线，见图2。

Table1PharmacokineticparametersforantazolinehydrochlorideinBeagledogplasmaafterintravenousadministration（Mean±SD，n=6）

Figure2Meanplasmaconcentration-timeprofileofantazolinehydrochlorideinplasmaaftersingleintravenousadministrationdoseof4.5mg?kg-1antazolinehydrochloridetosixBeagledogs.

4讨论

本实验内标在样品预处理前等量加入。选用非那西丁作内标，其与盐酸安他唑啉的色谱保留时间较为相近能完全分开，且不受内源性物质的干扰。

在样品处理过程中分别用甲醇和乙腈进行蛋白沉淀，结果内源性物质严重干扰测定。基于内源性物质的性质，创造一个碱性环境用于排除内源性影响。通过在萃取剂中加入NaOH，饱和Na2CO3及NaHCO3来研究其对提取过程的影响。当采用乙酸乙酯时盐酸安他唑啉的萃取回收率≥87%和内标回收率≥75%。而使用其他萃取剂时，萃取回收率明显降低或是波动较大。最后在前处理血浆样品中加入0.1mol?L-1NaOH来降低内源性的干扰。

参考文献：

[1]李青，朱兆仪，向菊兰，联合应用胺碘酮及安他唑啉治疗阵发性心房颤动及维持窦性心律的疗效观察（摘要）.中国循环杂志，1996（7）：第48页.

[2]刘群，韩志红与姜腾勇，盐酸安他唑啉联合胺碘酮治疗老年人阵发性心房颤动的临床疗效.中国心血管杂志，2009（2）.

[3]REYNOLDS，E.J.，W.M.BAIRDandM.E.CLIFFORD，ACLINICALTRIALOFANTAZOLINEINTHETREATMENTOFARRHYTHMIAS.AmJCardiol，1964.14：p.513-21.

[4]LeonardS.Dreifus，T.F.M.Y.，Clinicalandphysiologieeffectsofantazoline，anewantiarrhythmicagent.AmericanHeartJournal，1963.65（21）：p.607-614.

[5]Farkowski，M.M.，etal.，Clinicalefficacyofantazolineinrapidcardioversionofparoxysmalatrialfibrillation--aprotocolofasinglecenter，randomized，double-blind，placebo-controlledstudy（theAnPAFStudy）.Trials，2012.13：p.162.

[6]Downar，E.andM.B.Waxman，Antazolinetherapyofrecurrentrefractorysupraventriculararrhythmias--apreliminaryreport.CanMedAssocJ，1975.113（5）：p.391-3.

[7]DownarE，WaxmanMB.Antazolinetherapyofrecurrentrefraetorysupraventriculararrhythmias-apreliminaryreport[J].CanMedAssocJ，113（1975）391-393.

[8]LC-MS法测定大鼠血浆中长春瑞滨浓度及其药动学研究。中国药科大学学报，2008；39（4）：329～332.

[9]LC-MS法测定大鼠血浆中银杏内酯B的浓度.药物分析杂志，2009；29（1）：48～52.

作者简介：石迎迎，女，药师，硕士，专业：药理学，方向：药物代谢动力学，工作单位：郑州人民医院。