临床冰冻组织样本低温冻存前时长对样本质量的影响

顾雯茜，缪应雷

昆明医科大学第一附属医院消化内科·云南省消化疾病研究所云南省昆明市650032

通讯作者:缪应雷,主任医师,博士生导师,650032,云南省昆明市五华

区西昌路295号,昆明医科大学第一附属医院消化内科,云南省消化疾病

研究所[e-mail]

摘要建立生物样本库是转化医学及精准医学的基础，近年来在欧美及我国受到越来越多的重视。而随着世界经济的高速发展，基因、蛋白质、细胞及组织代谢方面的宏观及微观技术的发展使其在新时代个性化医疗中扮演尤其重要的角色。相较于传统的福尔马林固定石蜡样本，冰冻生物组织样本所提供的含量及质量更高的核酸及蛋白更能适应当代实验对宏基因组或靶点基因研究的要求[1]。人们因此越来越积极的探索如何建立高质量的生物样本库。本文旨在讨论冰冻样本进行超低温冰冻储存前时长对样本质量的影响。

关键字生物样本库;冰冻组织样本;超低温冻存前时长;样本质量

Theeffectofthelengthoftimebeforfrozentissuegetcryogenicstorageonfrozentissuesample'squality

Wen-XiGu，Ying-LeiMiao

Wen-XiGu，Ying-LeiMiao，DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity;YunnanInstituteofDigestiveDisease,Kunming650032,YunnanProvince,China

Correspondenceto:Ying-LeiMiao,ChiefPhysician,DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofKunming

MedicalUniversity;YunnanInstituteofDigestiveDisease,

295XichangRoad,WuhuaDistrict,Kunming650032,Yunnan

Province,[e-mail]

Abstractbiobankisacriticalinfrastructurefortranslationalmedicineresearchandprecisemedicalresearch,whichhasbeenpaidincreasingattentioninWesterncountriesandchina.Furthermore,Withtherapiddevelopmentoftheworldeconomy,thedevelopmentofmacroandmicrotechnologyingene,protein,cellandtissuemetabolismmakesitplayaparticularlyimportantroleintheneweraofpersonalizedmedicaltreatment.Comparedwiththecommomformalin-fixedparaffinembedded(FFPE),thehighernucleicacidandproteinwhichfrozenbiologicaltissuesamplescancontainismoresuitableforthestudyofthemacrogenomeortargetgeneinthecontemporaryexperiment.Thus,Peoplearemoreandmoreactivelyexploringhowtobuildhigh-qualitybiobank[1].Thepurposeofthispaperistodiscussthetimebeforfrozentissuegetcryogenicstoragehowtoeffectitsquality.

KeywordBioban;frozentissue;time;samplequality

1.概述临床冰冻生物样本库

1.1生物样本的定义

目前国际上对于生物样本库尚无统一的定义，较为广为人知的概念有:经济合作与发展组织2001年将其定义如下：生物资源中心（BiologicalResourceCenter,BRC)是支撑生命科学和生物科技的基础设施其构成主要包括众多储存和供应机构。此种机构可提供活细胞、有机体基因组以及与生物系统的遗传和功能相关的信息。BRC收集可培养的生物体(如微生物、植物、动物以及人类细胞)及其中可复制的成分(如基因组、质粒、病毒、cDNA)、有活性但是不能培养的有机体、细胞和组织与含有这些收集物的分子、生理、结构信息以及相关生物信息学的数据库[2]。国际生物和环境样本库协会(InternationalSocietyforBiologicalandEnvironmentalRepositories，ISBER)则称这种生物样本库为：“生物样本库（Biobank）”。具体定义为“接收、储存、处理及分发样本的组织机构，包含其地理位置及与其运营相关的所有活动”[3]。

为了推动生物样本库的发展及今后更好的对其进行质控工作，国际标准化组织(InternationalOrganizationforStandardization,ISO)的生物技术委员会(ISO/TC276)已经开始制定关于生物样本库通用要求的国际标准。目前被我国更多接受的是“BioBank”的概念，但在不同领域，对这一概念的翻译仍有较多不同。如临床上有些医院将储存组织样本的机构称为“组织样本库”等等。在此方面还有待与国际更好的接轨与同步。

1.2冰冻生物样本的发展过程

人们首次发现低温可用于生物组织的长时间保存始于1949年，生物学家在偶然发现甘油处理过的精子可在低温条件下经历一段时间后仍有活性。实验发现经40%甘油玻璃化及低温处理后精子的活性可以很好地复苏。并针对甘油的不同浓度及不同的用以玻璃化的试剂做实验得出以下结论。但是低温处理对精子活性保存的作用机制没有得到很好地解释[4]。

至1980年，有研究者发现在液氮温度下保存12年复温后的红细胞，在生化和功能上没有发生明显的差异，从而再次实践证明了虽然生物体在降温保存和复温的过程中易发生损伤，但其确实可以在低温环境下长期存活[5]。

生物冷冻样本发展至今，人们已经能够将简单的细胞进行低温保存。对于较大组织的保存，以目前的技术存在较大的局限性，只能做到保存其中最主要的细胞。如需更进一步的在对生物体损伤较小的条件下实现对复杂细胞、器官的长期冰冻保存，甚至是实现人体低温保存，还需要更深入地研究[5]。

1.3冰冻生物样本的分类

根据BRC对生物样本库的定义，其对可收集的样本范畴做出了具体划分。主要包括三个部分：（1）可培养的生物体及其中可复制的成分；（2）有活性但是不能培养的有机体；（3）细胞和组织与含有这些收集物的分子、生理、结构信息以及相关生物信息学。

但于临床医学中，组织样本库收集的样本集中于对人体细胞，组织、器官及其生物学信息的采集、储存、利用。根据其来源不同大致可分为两类。一类为：体液样本，如唾液、血液、尿液、精液、乳汁、粪便等。另一类为：组织样本，如组织、毛发、指甲等;而从血液样本中又可分离出血浆、血清、红细胞、PBMCs(外周血单个核细胞)、DNA和RNA等。以及与这些生物样本相关的知情同意、病理、临床、治疗和随访等资料及其质量控制与信息管理系统[6]。值得注意的是，在对样本的分类中，血液被归在了组织样本一类中。

对于这些样本的保存有多种方式，包括福尔马林固定石蜡样本、低温冷冻保存等。其中采用低温冷冻保存的组织样本则属于冰冻生物样本（frozenbiospecimens）的分类的范畴。随着世界经济的高速发展，基因、蛋白质、细胞及组织代谢方面的宏观及微观技术的发展使其在新时代个性化医疗中扮演尤其重要的角色。相较于传统的福尔马林固定石蜡样本，冰冻生物组织样本所提供的含量及质量更高的核酸及蛋白更能适应当代实验对宏基因组或靶点基因研究的要求[1]。

1.4样本低温处理的基本原理及常用方法

我们认为，低温保存生物样本组织的基本原理为低温条件下生物代谢活动速率减缓，引起的损伤较小，更大程度的保持生物材料的活性，生化及结构功能。生物冰冻组织样本从采集、储存到后期实验利用，样本必须经过降温、低温储存、复温过程。细胞在降温过程中，随着环境温度降低，在液相冷却时间段（t1段）内，细胞外液结晶。细胞所处环境到达冰点（0℃）后，细胞内液逐渐析出，细胞内液渗透压增大，细胞在此过程中发生皱缩，发生变相热释放，环境温度相对持平（t2段）。随后过渡到细胞内液及内容物结晶，环境温度再次快速下降至超低温（＜80℃），即为固相冷却时间段（t3段），并最后置该温度下下储存。在此过程中，若环境降温过快，细胞内液未充分析出，在细胞内形成冰晶，由此造成的损伤我们称为“机械损伤”；反之，若环境降温过慢，细胞外溶液中的水分不断结冰，使水分过分从细胞内通过细胞膜向外渗透，使细胞收缩并处于高浓度溶液中，细胞受到损伤而死亡，这是低温损伤的一个因素，称为“盐类损伤”[7]。不同的生物组织对应其相应的最适降温速率，一般来说，人体红细胞在低浓度抗冻剂中的最佳冷却速率约为100℃/min，胚胎细胞的最佳降温速率一般为0.2～0.8℃/min，而对于更大更复杂的细胞，则要求降温速率更慢[5]。

临床上本低温处理的常用方法主要分两种：其一为慢速冷却低温保存法。基本分为三步：将放在抗冻剂的细胞及溶液缓慢经过预处理后经缓慢降温到到一定的低温时，再快速降温至液氮温度，并长期保存在此温度下。其二为玻璃化低温保存方法。玻璃化是指液体转变为非晶态（玻璃态）的固化过程。玻璃化比普通的冻结固化方法引起的结构变化要小，是一种比较理想的低温保存途径。玻璃化低温保存组织样本依赖于寻求容易实现玻璃化并且对细胞损害较小的溶液及设法提高冷却速率[5]。

2.冻存前样本放置时长对样本质量的影响

临床上建立冰冻生物样本库大致分为、研究及样本库设计、样本采集及采集后处置、超低温冰冻储存、临床信息采集、样本利用几个步骤。在影响样本整体质量的众多因素中，样本的采集后放置温度及时间是其中必须考虑并可控的因素之一。在临床上更为特殊的人体组织样本库建立过程中，组织大致经过以下几个温度变化阶段：切除组织的体内热缺血时间、体外室温热缺血时间、普通低温放置时间、快速冷冻时间[8]。英国国家癌症转换医学研究网络、英国牛津大学及Radcliffe医院在2007年联合发表的《收集新鲜冻组织样本的标准化流程》中,新鲜冰冻组织样本从离体到超低温储存间隔时间应小于30分钟。如该时间段大于2小时，并入库的组织样本应对其时间延长造成的质量上的影响进行独立评估并记录[9]。生物样本库冷冻样本质量控制主要涉及其中蛋白质、DNA、RNA和组织样本等的质量评估[8，10-12]。

通过查阅文献，我们分析了样本冻存前放置环境及时长对样本DNA、RNA、蛋白质量及细胞活性各有不同的的影响。进而对样本冻存前放置环境及时长对冰冻组织样质量的影响有所了解。

2.1样本冻存前放置时长对冰冻组织样本中核苷酸质量的影响

样本中的核苷酸主要包括DNA及RNA，对样本DNA及RNA质量的检验主要是对其浓度、纯度及完整性的检测。其中RNA较DNA是更容易降解的生物大分子，因此对样本中RNA浓度、纯度及完整性的评估是样本核苷酸质量评估的重要标准。对本冻存前放置环境及时长对样本中核苷酸质量的影响程度的研究结论则存在较大差异。

2007年英国国家癌症转换医学研究网络、英国牛津大学及Radcliffe医院在联合发表的《收集新鲜冻组织样本的标准化流程》中,新鲜冰冻组织样本从离体到超低温储存间隔时间有明确的规定（小于30分钟，如该时间段大于2小时，并入库的组织样本应对其时间延长造成的质量上的影响进行独立评估并记录）对样本超低温储存前放置时长对样本质量的影响持肯定态度。同时，Tsui等人的研究表明，血液中的RNA，在取样至低温保存间时间间隔＞3h时，其转录水平较血液离体时明显下降[9]。

另一方面，也有一些科学家认为：样本冻存前放置时长在一定限度内对冰冻组织样本中核苷酸质量的并无显著影响。有研究表明血液中的DNA再被取样后的24小时内放置于4℃普通低温下，实验未发现有明显的纯度及完整度下降。MickeP,OhshimaM等人也在2006年试验得出在室温下过夜储存（16小时）后扁桃体组织中的RNA也处于稳定状态[13]。此外，LorisDeCecco1等人[14]，在2009年通过采集11位乳腺癌患者的癌组织，对其分别进行立即快速冷冻，室温下放置2,6,24小时处理后进行样本中RNA质量测定。RNA在冷冻保存的乳腺肿瘤样品中在冷冻前高达24小时内也是稳定的。得出相同结论的还有BaoWG等人[15]在2013年的实验通过从5个不同患者采集的新鲜结肠癌组织在快速冷冻至超低温前分别于零度下放置0.5,1,2,4h，检测样本中的RNA完整性系数值(RNAintegritynumber，RIN)无明显降低。从而得出结论：RNA可以在超低温快速冷冻保存前在普通低温（小于4℃）4小时内保持稳定。

以上我们可以看出冰冻组织样本中核苷酸的高质量保存对其冻存前放置时长有一定要求，但对该时长的具体把握也许不仅相同。可能与不同组织器官热缺血时间对细胞核苷酸物质的损伤有关[16]。

2.2样本冻存前处理时长对样本蛋白质质量的影响

由于蛋白质种类繁多，其质控也更为复杂。目前蛋白质的质量主要从其浓度与完整性两方面来进行评估。

蛋白质浓度常用凯氏定氮法、双缩脲法、Folin－酚试剂法(又名Lowry法)、考马斯亮蓝法(又名Bradford)、紫外分光度检测法、二辛可宁酸法(又名BCA法)等方法测定蛋白质浓度。

蛋白质完整性的检测有一定难度：2015年DunneJC在肿瘤领域发现石蜡包埋样本的差异蛋白质谱，但差异蛋白分子量往往在50kD以下。2016年上交肿瘤研究中心，尝试以考马斯亮蓝染色法引入对蛋白质完整性的评估[17]。

我们通常认为样本冻存前室温下放置时长延长会造成样本蛋白质质量下降。近年也有研究者采用质谱法测量血清样本离心分离前分别于不同储存条件(室温、湿冰、干冰)放置不同时间(12、24、36h)、以及反复冻融(直至第4次)后14种氨基酸浓度的变化。结果表明血清样本在室温或干冰下放置不同时间均会有不同氨基酸浓度的变化，冻融2次以上也会出现蛋白质的降解[18]。这一实验也证明了上述观点。同时，Walker[19]的对心肌细胞中肌钙蛋白I及肌钙蛋白T在不同冷冻时长下表达含量的实验得出的结论与这一观点也较为一致。此外，美国乳腺癌组织样本质控指南目前推荐组样本的缺血时间（包括组织离体后的冷缺血及热缺血时间）小于1小时[20]。

2.3冻存前时长对样本细胞质量的影响

细胞作为一类重要的实验资源，细胞浓缩物可用于功能研究，流式细胞术，

培养实验，或作为细胞核酸的来源。人体血液活细胞可在室温下存活48h，但之后需通过培养或者超低温保存（-150℃）保持细胞在研究中的价值[21]。相对来说细胞的质量控制对样本冰冻储存前的时长要求较低。

3.结语与展望

在建立临床人体冰冻组织样本库的过程中，影响样本质量的因素繁多。但以样本内核苷酸、蛋白质、细胞活性三个方面评估样本质量来说，样本超低温储存前经历时长对样本质量的影响客观存在，具体的样本超低温储存前时长的控制目前还没有统一的SOP。但是在保证基本的样本中的细胞、蛋白质及核苷酸质量的基础上，根据不同实验的顶层设计，为保证不同的样本的质量，低温长期储存前时长也必定存在不同的标准，需要根据具体情况分析。高质量的样本是保证研究结果精准的前提，通过加强对样本库运行的管理及不断对样本库相关工作人员进行培训缩短冰冻组织样本冻存前时长是建立一个合格的生物样本库的必要措施。

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