一氧化氮合酶的亚细胞结构状态对心血管的作用机制

丁娜金振一关成明矫雨金春子

（延边大学附属医院吉林延边133000）

【摘要】一氧化氮合酶是无处不在的同工酶，在调节心功能中发挥了举足轻重的作用。eNOS和nNOS是同源结构，并利用相同的辅助因子和基质。然而，它们有不同的亚细胞定位、调节和下游信号，这些都可以导致不同的心肌激动–收缩偶联效果。文献报道，eNOS源性NO作用体现在增加左心室的顺应性，减轻β-肾上腺素受体的收缩力，增强副交感神经的反应性，通过cGMP依赖的信号传导通路来实现β3肾上腺素能受体的的负性肌力反应。相反，nNOS源性NO调节是通过抑制心肌细胞膜的钙电流、促进蛋白激酶A依赖受磷蛋白（PLN）的磷酸化，调节心肌收缩力及加速心肌细胞松弛。我们通过查阅文献，从NOS的亚细胞定位，与下游信号，进行论述NOS在心肌细胞的作用机制。

【关键词】nNOS；eNOS；信号通路；心肌功能

【中图分类号】R54【文献标识码】A【文章编号】1004-6194（2015）02-0169-02

1一氧化氮合酶的亚细胞结构

1980年R.F.Furchgott等人提出一氧化氮(Nitricoxide，NO)可以启动鸟苷酸环化酶(GC)，松弛平滑肌开始至今，对NO的研究仍然是全球生命科学和医药界最热门的前沿领域之一。NO是一种人体内普遍存在的分子，几乎参与所有细胞的调控功能，包括代谢、细胞生长、增殖、凋亡。在心血管系统中起着举足轻重的作用，在心肌收缩过程中，通过调节钙离子等下游靶向信号来调节心肌细胞和血管平滑肌细胞的舒张活动。

NO在心血管系统是由一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)蛋白家族合成的多能性调节气体。NOS转化L-精氨酸（L-arginin）的胍基氮生成NO，副产物L-胍氨酸（L-citrulline）及氧气［1］。NOS是一组同工酶，根据存在的部位及作用机制，可分为结构型NOS（cNOS）和诱导型NOS(iNOS)两类，而cNOS包括神经型NOS(nNOS或NOS1)和内皮型NOS(eNOS或NOS3)两种。已知哺乳动物的心肌持续表达nNOS和eNOS[2]。nNOS首次发现存在于小脑而得名。1999年，Xu等第一次发表了心肌肌浆网（sarcoplasmareticulum，SR）表达nNOS[3]，后来发现血管平滑肌细胞[4]中也表达nNOS。eNOS也在血管内皮细胞和心肌细胞中表达[5]。eNOS和nNOS都是由二聚体构成；二聚体中的每个单体含有一个氨基末端的酶结构域（N端）和一个羧基末端还原酶结构域（C端）。该酶结构域结合底物L-精氨酸和含有四氢生物蝶呤（BH4）的辅助因子及细胞色素p-450-type细胞色素转化酶。还原酶结构域包含黄素结合位点（FMN，FAD）和NADPH（电子供体）。两单体二聚化通过沿行钙结合与钙结合蛋白（CaM），将羧基末端的电子转移到还原酶域的含血红素的氨基末端结构域[2]。

2内皮型一氧化氮合酶和神经型一氧化氮合酶调节心肌功能的分子机制

NO对心肌收缩的影响已在许多体外心脏研究中证实（即，心肌细胞，离体心脏），同时也在动物模型和人类体内实验中证实。但是从以往的实验研究结果来看NO多在心肌细胞中肌肉收缩偶联的Frank–staling机制和Anerpeffect效应相关联。多年来，eNOS被认为是唯一的在心肌细胞中的NOS亚型。自从1999年在心肌细胞中发现nNOS[3]以来，开启了一些新的研究领域，是因为在心肌细胞中nNOS一旦被释放，就会通过肌红蛋白和超氧阴离子的清除作用在心肌细胞中扩散。并且，eNOS和nNOS有各自的信号通路效应。事实上，eNOS大多局限在细胞膜并与Caveolin-3结合[6]，nNOS主要是，分布于SR，与雷诺丁受体(ryanodinereceptor,RyR)和黄嘌呤氧化还原酶（xanthineoxidoreductase,XOR）相邻近[7,8,9]。然而，eNOS和nNOS能定位于不同的亚细胞并各自响应外界的刺激或通过不同信号途径来防御疾病。例如，缺血/再灌注[10]和左心室损伤的心肌中[11,12]nNOS转位到细胞膜中表达[13]，而eNOS从细胞膜的Caveolin-3转移到细胞内的细胞器中表达，如高尔基体或细胞核[14,15]，也可以转移到RyR[16]。在过去的三十年，我们对心肌NOS的认识有了明显的提高。然而，NOS的分子机制仍不清楚，尚存在许多疑问。本综述通过查阅相关文献，着重论述NOS信号通路在心脏功能调节中的作用机制。

关于NO的旁分泌作用是通过冠状动脉内皮细胞对左心室顺应性实验来证实的。在人类中，由P物质对eNOS活性的刺激，证明NO会导致左心室收缩期峰值压力减少、显著增加收缩性能和左室舒张末期扩张性[17]。这理论，利用NO释放剂和cGMP类似物可再现。它们通过PKG介导的肌钙蛋白的磷酸化并降低肌丝钙敏感性，从而达到调节目的。在增加左心室顺应性的实验中，其分子机制可能是eNOS参与并调节了Frank-staling[18]。然而，基础条件相同的eNOS基因敲除实验中发现，无论是eNOS基因缺失与否，肌丝钙敏感性或Frank-staling机制反应无明显变化。这些结果表明，eNOS可能对心肌松弛和左心室顺应性作用不是很大。

与之相反的是nNOS基因的缺失和抑制将会影响心肌细胞收缩和左心室的收缩功能[19,20,21]，而在其他的实验中则得出相反的结论[22,23,24]。另外，这些实验的差异取决于实验条件的控制、实验动物的耐受性、实验模型的选择和实验条件的限制。在Barouch等[22]研究中通过使用C57BL/6实验鼠作为对照组时，就得出左心室收缩功能增加的结论。而Wang等人的[24]实验发现，当nNOS−/−小鼠在37°C环境中4Hz和6Hz频率的刺激下右心室收缩无明显差异，然而当在室温下用0.5Hz刺激nNOS−/−小鼠左室心肌细胞时可以明显缩短对SR钙离子超载反应。在zhang等实验中，通过把实验条件控制为3Hz，35°C时，将明显看出nNOS抑制钙离子内流的增加，SR中的钙超载量和钙瞬间释放量[2]。Burger等人同样得到相同的结论[25]。同样，通过nNOS基因的缺失与抑制心肌收缩力-收缩频率响应相关联的研究中，SR的Ca2+超载的增加将增大实验动物心肌的刺激频率的增加。另外有研究报道，nNOS结合与SR的RyR并对细胞膜钙离子内流与SR的钙超载起负反馈作用[23]。这些有助于了解nNOS与Ca2+调节酶和Ca2+释放通道的关联。然而关于nNOS来源的NO对细胞膜钙电流和RyR功能的调节，在早期和最近的研究中出现了完全相反的结果，早期的研究报告表明nNOS导致RyR开放概率和钙超载的增加，而最近的研究表明抑制nNOS[26]或nNOS−/−小鼠左心室心肌细胞舒张期Ca2+通道和[27]RyR开放概率将减少[23]，而这两个的减少都是由于RyR的S-亚硝基化。虽然不同的RyR的氧化和亚硝基化之间的平衡来解释这些差异[28,29]，但心肌NO的产生对RyR开放概率的影响仍然未完全阐明。

类似的研究，在β-肾上腺素刺激对nNOS−/−小鼠心肌收缩力影响的实验研究中，例如，CasadeiB研究组等发现2nmol/L的β-肾上腺素将使nNOS−/−小鼠心肌细胞收缩力增加[30]，但是高浓度的β-肾上腺素时则无明显差异[31]。在体内实验时，许多研究发现，左室心肌细胞对β-肾上腺素能受体激动剂反应迟钝[22,32]。最近的证据表明，在人类nNOS的抑制将导致内皮依赖性冠状动脉血流量的减少[33]，实验研究表明代谢需求和心肌灌注之间的不协调性可抑制nNOS−/−的小鼠心肌细胞对β-肾上腺素刺激产生的收缩反应，这也就解释了体内实验和体外分实验（分离心肌细胞）对β-肾上腺素能产生的收缩反应差异。

在这些相互矛盾的实验研究中，有一件事是肯定的，无论实验条件的差异有多大，还是选择的不同对照组，体内或者离体的心肌细胞中nNOS基因缺失或抑制nNOS，来自不同组织中的nNOS产生的NO，与在冠状动脉内皮源性NO，在加速心肌细胞松弛和左室顺应性上所产生的效果是不同的。

综上所述，选择性eNOS和nNOS基因缺失小鼠的研究有助于理解NO在心肌细胞中的作用。特别是，在生理条件下的心脏中，eNOS源性NO作用优先在血管内皮细胞刺激时产生的血管舒张。相反，心脏中nNOS源性NO通过调节SR中Ca2+的摄取率，来调节心肌收缩性。然而，目前许多方面仍不清楚，由于来自不同实验室的结果之间的不一致性可能预示着更多的重要机制尚未被发现—而这正是研究的诱人之处。在现实中，动物实验受到许多临床研究之外的事物的影响（举例来说，没有精确的实验计划、标准实验程序、在其他的事情中选择控件，没有随机双盲或者单盲对照），因此实验中很难排除实验机制的随意性。

3结论

总之，经过30年多的深入研究，我们才刚开始理解NO对心血管功能的调节。NO信号复杂的信号传导机制还没有完全清楚。期待NO这种神奇的小分子能在临床治疗中发挥作用。

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基金项目：

国家自然科学基金（81460039）；吉林省科技厅青年科研基金（20140520024JH）；吉林省卫生厅青年科研基金（2014Q043）

*通讯作者：

金春子