HPLC法测定金匮肾气丸中丹皮酚的含量

郑毅

哈药集团世一堂制药厂 150000

【摘 要】目的：选用HOLC法，对中药金匮肾气丸中丹皮酚的含量进行测定。方法:采用HPLC法（高效液相色谱法），色谱柱：BDS（4.6*250mm）柱；选择的流动相为：甲醇-水-冰乙酸（50:50:1）；检测波长为275nm，流速为1.0ml/min。结果：当测定药品溶液，丹皮酚的溶液浓度在0.01326mg/ml-0.05525mg/ml之间时，与锋面能够呈现出良好的线性关系，此时r=0.995，回收率为99.2%。结论：采用HPLC法，进行测定金匮肾气丸中丹皮酚的含量，其结果较为准确。该法也可以广泛用于金匮肾气丸中丹皮酚含量的测定，及进行质量控制。

【关键词】金匮肾气丸；丹皮酚；含量

肾为先天之本，五脏阳气之根。现代中医中的“肾”不为现代医学中国的单纯解剖学概念，主要由命门、肾、膀胱、二阴、耳窍、骨髓以及其所属经络等共同组成。祖国医学中，“主骨生髓”“肾藏精”“肾主水”“肾主纳气”等肾功能，主要是对神经、泌尿、内分泌以及生殖等一系列相关生理功能进行的概括。通过对肾阳虚进行大量研究，结果表明，最为经典的造模方法为应用氢化可的松建立肾阳虚模型，符合中医的证。肾阳虚动物主要伴有未老先衰症状，如耐力低下、体质量下降、精神萎靡不振、性能力减弱以及反应迟钝等 。金匮肾气丸主要包括熟地、山药、茯苓、山茱萸、牡丹皮、桂枝、泽泻以及附子等成分，将蜂蜜作为辅料，具备化气行水、温补肾阳的作用；配方中的山茱萸可发挥出补肝脾、益精血的作用；熟地可发挥出滋肾精的作用；泽泻主要具备清泻肾火的作用；山药具备滋精固肾的作用；牡丹皮可起到泻阴中之火的作用；以上药物成分联合后可发挥出协同作用，有效调整肾肝脾三脏共功能，起到补而补腻、泻邪不伤正的作用。

金匮肾气丸是一种中药合成类药品，其在临床治疗中，主要用于治疗患者的肾虚水肿、腰膝酸软等症状。其主要中药成分为牡丹皮、茯苓等。该药物一般是通过加工，制成大蜜丸的丸状药物。在《中国药典》中，有该类药物的概述，与功效、应用等说明。但该药典中，并未对该药物的相关成分的含量，进行记载。本文选用HPLC法，对中药金匮肾气丸中的丹皮酚含量进行测定，该方法具有操作简单、方法便捷等特点，并且具有测量结果准确、重复性好等优点。相关测量过程如下。

1.仪器、试剂与样品

仪器：L-2000高效液相色谱仪SHB-3循环水多用真空泵、BIO-TEK535紫外可见检测器、HL-01溶剂过滤器、真空泵HS3120、超声清洗器SVC-300高精度全自动稳压电源Anastar Elite LC Control色谱工作站、NST-890-0203 L-2200Auto-sampler自动进样器phenomenex C18色谱柱。

试剂：甲醇；色谱纯；无水乙醇，冰醋酸；其它试剂均为分析纯。

样品：金匮肾气丸、对照品：丹皮酚

2.实验与结果

2.1色谱条件

色谱柱BDS（4.6×250mm）柱温30℃；流动相甲醇-水-冰乙酸（50：50：1）[3]，流速1.0ml﹒min-1；检测波长275；灵敏度0.15AUFS，进样量10ul。在此条件下样品色谱中丹皮酚的峰达到基线分离，且阴性对照无干扰。

2.2标准曲线的制备

精密称取丹皮酚对照品（真空减压干燥置恒重）20mg，置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品储备溶液。精密量取对照品溶液1ml置10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度。制得丹皮酚标准溶液，取上述标准溶液，按文中的色谱条件分别进样5ul，10 ul，15 ul，20 ul，25ul测定，取三次峰面积的平均值作图，得一良好直线，数据经回归处理,方程为Y=2E+07X+35087.r=0.9997，丹皮酚在0.01-0.05mg·ml-1线性关系良好。

2.3供试品溶液的的制备

取重量差异项下的大蜜丸适量，剪碎，取约1.0g，精密称定，加硅藻土1.0g，研匀。精密加入70％乙醇50ml，称定重量，置超声仪中超声30min，放冷，称定重量，用70％乙醇补充减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4进样精密度考察

取对照品溶液（浓度为0.0242 mg/ml），连续进样5次，测定峰面积，计算其RSD=0.9％（n=5）结果表明该法精密度良好。

2.5阴性对照试验

按卫生部药品标准“金匮肾气丸”项下制备不含牡丹皮的阴性试液，按供试品制备方法制备，测定。

2.6重复性实验

精密称取同一批样品5份，按供试品制备方法制备，测定，结果表明测定重复性较好，RSD=2.8%,n=5。

2.7稳定性实验

取样品溶液，每隔1h进样一次，共进样6次，结果表明，丹皮酚峰面积值在6h之内稳定，RSD=1.28﹪（n=1.2）。

2.8加样回收率实验

精密称取供试品3份（每个批号各取3份），每份约0.5g，分别加入加入0.1mg/ml、0.2 mg/ml、0.3 mg/ml的丹皮酚，按样品测定项下方法制备成供试品溶液并测定其含量，计算回收率。

3.结果与讨论

3.1波长的选用

本次对照试验中，对波长的选择进行充分的研究，并选择波长200到400nm之间进行扫描测定紫外吸光谱。当波长在275nm时，波长的吸收最佳，因此本次试验中选择275nm波长，进行测定丹皮酚的含量。

3.2统计的提取方法选择

本次试验中，对不同溶剂的效果进行了大量考察，在看考察中发现，丹皮酚的提取结果与溶剂的选择并无太大影响。本文中采用了70%的乙醇溶剂，并附加超声30分钟辅助分解的方法，该方法的作用较为明显，也能够提取较高的含量。此外，以上方法具有操作简单，方便快捷的特点，并且能够节约提取试验的投入成本，因此该方法也可以进行广泛的进行推广。

3.3流动相的选择

本次的试验中，最初的流动相甲醇-水-冰乙酸的比例为（60:40:1）。在进行试验过程中，与对照品相比，在出峰相同的时间内，出现了波动现象，这种现象的产生，证明提取丹皮酚过程出现了干扰。针对干扰现象，对流动相甲醇-水-冰乙酸的比例进行了调整，在调整过程中，当流动相甲醇-水-冰乙酸的比例为（60:40:1），进行提取时，干扰现象并未消失。最终选择流动相的比例为（50:50:1）时，未发现干扰现象。故本次提取试验选择该比例的流动相，最为最终试验选择。

综上所述，随着医疗科学的快速进步，中药的发展也越来越完善。随着中药的快速发展，对中药的成分进行充分了解也十分必要。通过对相关中药的成分与含量，进行充分了解，也同样能够促进医疗科学的进步。

从文献资料来看，有关金匮肾气丸的药理研究报道多从对某一系统或某一病变指标的影响入手，观察该方的治疗效果并探讨作用机制。在实验中，多根据现代医学发病原理进行动物模型的复制或在西医学原有动物模型基础之上稍加改进而制作病理模型。这种研究方法固然可以在一定层面上揭示中药复方的某种体内作用规律，但由于中医学自身的特色及优势是宏观把握及整体调节，其临床遣药用方的基本思维是辨证论治和方证对应，以“病”为着眼点的中药药理学实验研究方法显然与中医“辨证用药”的治疗准则相差甚远。尽管建国以来，广大学者在中医证候动物模型的研究领域进行了积极的探索，然而迄今为止，成熟定论的动物模型并不多见。今后若能从改进动物模型入手，积极发掘现代医学病症和中医辨证分型之间的内在联系，尽快建立中医证候的客观综合指标体系，进而复制出符合该指标体系的中医证候动物模型，从方证对应的角度着手用药，立足整体，把握全局，将全方位、多层次、多靶点的指标检测纳入药物疗效评价标准，从多学科、多系统、多病种的角度探讨药物治疗机制，对于准确把握中药复方的体内作用原理以及客观评价中药复方的治验结果，将会更具权威性及说服力。

参考文献

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郑龙飞,韩玲,郝宇,et al.金匮肾气丸加味膏、汤方干预肾阳虚模型大鼠的药效学对比研究[J].北京中医药大学学报,2018(7):567-571.