苦参素对实验性肝纤维化的干预作用

【摘要】 目的：观察苦参素对四氯化碳（CCl4）诱导的实验性肝纤维化的干预作用。方法：将SD大鼠分成正常对照组、模型组、苦参素小剂量治疗组（40 mg/kg）、中剂量治疗组（80 mg/kg）、大剂量治疗组（160 mg/kg），造模4周后苦参素治疗至实验第10周，取血测相关血清学指标，计算肝脏指数，测定肝组织匀浆中HYP和MDA含量。结果：苦参素能降低肝纤维化大鼠血清丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、胆汁酸（TBA）、γ－谷氨酰转移酶（GGT）和肝脏指数，同时能减少肝组织中羟脯氨酸（HYP）和MDA含量（P<0.05或P<0.01）。结论：苦参素具有抗CCl4诱导的实验性肝纤维化的作用。

【关键词】 肝纤维化；细胞外基质；大鼠；苦参素；四氯化碳

Preventive effect of Kushenin on formation of experimental hepatic fibrosis in rats

E Qiukai， YU Linxi， ZHU Xinxin， et al （School of Life Science， Nantong University， Nantong 226007）

[Abstract] Objective:To investigate the intervention effect of oxymatrine on experimental liver fibrosis induced by carbon tetrachloride（CCl4） in rats. Methods: Sprague-Dawley （SD） 50 rats were randomly pided into 5 groups: the normal control group， model control group without treatment， model with oxymatrine treatment of low dose（40 mg·kg-1）， middle dose（80 mg·kg-1） and high dose group（160 mg·kg-1）. The rat liver fibrosis model was prepared by administration of CCl4. In the development of fibrosis， oxymatrine was administered to rats from the 4th week to 10th week after CCl4 induction. Then rats were sacrificed， the serology related indicant in rat serum， liver index， content of HYP and MDA in the homogenate of hepatic tissue were measured. Results: Oxymatrine lower the level of ALT， AST，TBA，GGT in serum and liver index as well reduced the HYP and MDA content in liver tissues in liver fibrosis model rats. Conclusion: Oxymatrine has protective effect on CCl4-induced liver fibrosis in rats.

[Key words] Liver fibrosis; Extracellular matrix; Rat；Oxymatrine; Carbon tetrachloride

肝纤维化（liver fibrosis）是各种慢性肝病发展为肝硬化（1iver cirrhosis）的必经阶段。肝纤维化是由各种因素引起肝细胞损害和炎症，在修复过程中导致肝脏细胞外基质（extracellular matrix，ECM）异常增多和过度沉积的病理过程。苦参素又称氧化苦参碱，是由中药苦豆子和苦参根中提取的一种生物碱，一般认为其具有抗炎、抗病毒、调节免疫反应，抗肿瘤等生物学作用[1-2]。本研究观察苦参素对CCl4诱导的实验性肝纤维化的干预作用[3]，为进一步开发利用苦参素提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠70只，体重140~160 g，雌雄兼用，由南通大学实验动物中心提供。动物许可证号：SCXK（苏）2002-0019。所有动物自由摄食，饮水。

1.2 药品与试剂 （1）四氯化碳（CCl4）：宜兴市第二化学试剂厂，批号20010608，使用时用食用花生油配制成40%的油溶液；（2）苦参素：（主要成分为氧化苦参碱oxymatrine， OM）:江苏正大天晴药业股份有限公司，批号:20021004。细结晶颗粒，按需用灭菌生理盐水配制呈溶液使用；（3）丙二醛（MDA）测定试剂盒，南京建成生物医学工程研究所，批号：20030307；（4）羟脯氨酸（HYP）含量测定试剂盒，南京建成生物医学工程研究所，批号：20030321。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组及模型制备[4] SD大鼠50只，随机分为5组：Ⅰ正常对照组、Ⅱ模型组、Ⅲ 苦参素小剂量治疗组（40 mg/kg）、Ⅳ苦参素中剂量治疗组（80 mg/kg）、Ⅴ苦参素大剂量治疗组（160 mg/kg），每组10只动物，雌雄各半。各造模组均采用CCl4诱导大鼠肝纤维化模型：用40%CCl4花生油溶液3.0 ml/kg皮下注射，每周2次，共10周；动物每周称重1次，并根据体重调整CCl4的剂量，正常对照组仅以花生油等容量皮下注射。苦参素治疗组从CCl4造模后第4周开始至第10周腹腔注射给药，每日1次，给药容量均为1.0 ml/kg。正常对照组、模型组腹腔注射等容量灭菌生理盐水，每日1次。

1.3.2 肝功能的检测 造模至第10周末，全部动物禁食16 h后，断头取血。血液40 ℃条件下2000 rpm离心15 min，吸取血清于4 ℃冷藏，24 h内用生化自动分析仪测定谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、胆汁酸（TBA）和γ－谷氨酰转移酶（GGT）。

1.3.3 肝脏指数的测算 造模至第10周末，全部动物称体重。取血后，将动物解剖，取出肝脏，滤纸拭干，置于电子天平上称重，以肝脏指数＝肝脏重量/体重×100，计算肝脏指数。同时剪取肝脏组织-20 ℃保存，备制作肝匀浆液之用。

1.3.4 肝组织中HYP和MDA含量的检测 取10％肝组织匀浆液测定每份肝匀浆中HYP和MDA与特定试剂反应后溶液的吸光值，并根据肝组织匀浆液中总蛋白的含量，分别计算肝脏中HYP和MDA的含量。

1.3.5 统计学方法 使用Stata6.0统计软件包进行数据处理。数据以■±s表示，用单因素方差分析和F检验处理数据，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 动物一般情况 实验过程中，正常对照组动物一般情况良好；模型组动物毛色暗淡，活动减少；食量下降，尿色发黄，部分动物出现慢性腹泻症状；各治疗组动物一般情况在给药后逐渐改善。实验结束时可见正常对照组大鼠肝脏大小正常，色泽暗红，质地光滑柔软，细腻；模型组大鼠肝脏大多明显肿大，颜色灰白，肝质地变硬，边缘变钝，表面呈粗糙桔皮状，可见明显的、均匀分布的小结节，个别动物部分肝叶与腹腔其它脏器有黏连，且有腹水出现，腹水颜色尚清。余各治疗组动物肝脏体积稍大，颜色稍显灰黄，包膜略紧张，质地略粗糙，但无小结节形成，无1例出现腹水。

2.2 肝功能的检测 见表1。各治疗组间肝功能测定数值差异均无统计学意义（P>0.05）。

2.3 肝脏脏器指数及肝组织中HYP、MDA的检测 见表2。小剂量治疗组与模型组比较，肝脏指数虽有所减少，但差异无统计学意义（P>0.05）；各治疗组间HYP和MDA含量差异亦无统计学意义（P>0.05）。

3 讨 论

血清ALT、AST和TBA主要与肝细胞损伤、坏死程度呈正相关。我们实验结果显示，造模第10周末模型组动物的肝脏脏器指数、血清ALT、AST和TBA明显高于正常对照组（P<0.01），苦参素各治疗组动物的这些指标均明显低于模型组（P<0.01）。说明苦参素能很好的保护肝细胞，减少肝细胞损伤。提示苦参素在抑制肝纤维化的发生方面可能具有一定效果。

血清中GGT升高则提示向慢性活动性肝炎转化，测定GGT对慢性肝炎及肝硬化的诊断及预后监测有参考价值[5]。HYP主要存在于胶原中，HYP含量的测定是衡量机体胶原组织代谢的重要指标，故肝组织HYP含量能客观反映肝纤维化程度。结果显示模型组HYP和GGT的值均高于正常对照组（P<0.01），苦参素各治疗组的值均明显低于模型组，这说明苦参素在减少胶原合成，减轻纤维化方面有较好作用。

近年研究发现自由基所致的细胞膜脂质过氧化反应不仅参与了肝组织损伤[6]，且对肝纤维化胶原代谢有一定的影响。大量研究表明，在CCl4、乙醇等所引起的肝纤维化过程中，自由基引起的脂质过氧化不仅参与了起始阶段的肝损伤过程[7]；而且脂质过氧化产物MDA可直接刺激星状细胞活化及胶原基因表达[8]。我们的研究数据也显示MDA参与了肝纤维化的过程，而苦参素各治疗组肝内的MDA较模型组均有明显下降（P<0.01），提示苦参素能减少脂质过氧化的自动分解产物MDA的生成。说明该药物的抗氧化作用不但在肝纤维化形成的早期阶段能减轻肝损伤，而且在纤维化的发展阶段也能起到抑制肝星状细胞活化和胶原表达的作用。

本实验应用苦参素治疗大鼠肝纤维化，结果显示；苦参素能通过减少MDA的生成，减轻肝损伤，能抑制大鼠肝内HYP生成，产生抗肝纤维化作用。鉴于苦参素无明显毒副作用，有望成为很有前途的抗肝纤维化药物，其作用与机理还有待进一步深入研究。

【参考文献】
[1] 张一宁， 牛俊奇. 肝纤维化.见:李才主编.器官纤维化基础与临床[M]. 北京：人民卫生出版社.2003:74-76.

[2] 周建明. 苦参素治疗慢性乙型病毒性肝炎78 例效果观察[J]. 南通医学院学报，2004，24（2）：201-203.

[3] 闫 波， 陈飞虎， 吴繁荣， 等.鬼针草总黄酮对肝纤维化大鼠治疗作用及机制探讨[J]. 中国药理学通报，2008，24（12）:1640-1645.

[4] Zim MC， Silveira TR， Schwartsmann G， et al.Potentiation of carbon tetrachloride hepatotoxicity by pentosen polysulfate in rats[J]. Braz J Med Biol Res，2002，35（11）:1339-1346.

[5] 唐海燕， 董江龙， 王建彬， 等. 肝组织碱性成纤维细胞生长因子与乙肝患者肝纤维化关系的研究[J]. 临床肝胆病杂志，2008，24（6）:454-555.

[6] Liu J， Sendelbach LE， Parkinson A， et al. Endotoxin pretreatment protects against the hepatotoxicity of acetaminophen and carbon tetrachloride: role of cytochrome P450 suppression[J]. Toxicology，2000，147（3）:167-176.

[7] Poli G.Pathogenesis of liver fibrosis: role of oxidative stress[J]. Mol Aspects Med，2000，21（3）:49-98.

[8] Miyahara T， Schrum L， Rippe R， et al. Peroxisome proliferator-activated receptors and hepatic stellate cell activation[J]. J Biol Chem，2000，275（46）:35715-35722.