1- methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine对C57BL小鼠行为学及纹状体多巴

摘　要　目的：观察不同MPTP剂量对小鼠行为学及胸纹状体多巴胺，去甲肾上腺素，5-羟色胺及其代谢产物含量的影响，探讨MPTP致PD小鼠模型的最佳条件。方法：各组C57BL小鼠分别给予MPTP不同单日剂量，不同给药次数处理，测定各组小鼠爬杆时间检测动物运动协调性，测定其自发活动记数评价动物神经兴奋性，测定通道式水迷官游出时间评价各组小鼠空同学习记忆能力。应用高效液相色谱法检测动物纹状体内多巴胺，去甲肾上腺素，5-羟色胺及其代谢产物含量。给果：除小剂量组（20mg/kg）外，其余各组小鼠在MPTP给药后都出现不同程度爬杆时间延长，自发活动次数减少，但小鼠通道式水迷官游出时间在给药前后未见明显改变。MPTP处理组与对照组相比多巴胺（DA）及其代谢产物（DOPAC）含量都有明显降低。去甲肾上腺素（NA），5-羟色胺（5-HT）及其代谢产物（5-HIAA）都未见明显改变。结论：除小剂量组（20mg/kg，连续用药3天）外，各MPTP处理组都可造成小鼠的帕金森病样症状。MPTP致PD的小鼠动物模型不伴有明显智力障碍。在此种动物模型中，应根据科研目的选择MPTP的应用剂量和给药途径。
关键词：1-甲基-4　苯基-1，2，3，6-四氢吡啶　帕金森病　多巴胺　C57BL小鼠
　　　　蚊状体
　　近年来，借助于帕金森病动物模型的成功建立，人们对帕金森病的认识不断增加。目前，较为常用的帕金森病样动物模型包括：恒河猴静脉注射MPTP，应用6-羟多巴对大鼠黑质纹状体的定向损毁，C57BL小鼠腹腔注射MPTP。其中，应用中毒剂量的MPTP使猴产生的动物模型在症状，生化和病理方面的改变都与帕金森帕临床病人十分相似，但其造价较高。应用6-羟多巴注人大鼠一侧黑质所产生的动物模型，在症状和病理上，与人的帕金森病不完全吻合。小鼠在应用较大剂量MPTP后，也可以产生与临床病人十分相似的病理，生化改变，是一种较好的动物模型。但是，应用小鼠功物模型的过程中，尚存在着问题：临床病人多为慢性起病，症状逐步加重，最终病人丧失正常生活自理能力。而目前所采用的小鼠动物模型多为应用大剂量MPTP损伤动物多巴胺能神经元，导致动物短期内出现震颤，僵直，运动不能等类帕金森样症状，不能完全模拟临床病人的疾病过程。为探讨究竟何种给药方法最可以反映临床病人的慢性疾病过程，建立更好的动物模型，服务于临床研究，我们对C57BL小鼠给予不同的给药剂量，观察评价小鼠行为学并采用高效液相色谱法测定各组动物纹状体内多巴胺及其相关代谢产物的含量。

材料与方法：

1　材料
1.1　动物
　　 C57BL小鼠，雄性，6-7周龄，体重18±2克,由中国医学科学院动物养殖场提供，合格证：京动管制字：01-3004
1.2　试剂
　　 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP），多巴胺（Dopamine，DA），去甲肾上腺素（Norepinephrine，NA），5-羟吲哚乙酸（5-hydroxyindole-3-acetic acid，5-HIAA），5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）二羟基苯乙酸（dihydroxyphenylacetic acid DOPAC），高香草酸（homovanillic acid，HVA），辛完磺酸钠盐（octylsulfate sodium salt）均为sigma公司产品。磷酸二氢钠，乙二胺四乙酸二钠为北京化学试剂公司分析纯试剂，甲醇为天津四面体化工厂色谱纯试剂。
1.3　仪器
　　CS-2型小鼠自主活动程序仪，由中国医学科学院药物研究所研制。通道式水迷宫，由中国医学科学院药物研究所研制。根据Nobutaka Arai等的实验方法自制爬杆时间测定杆。日本SHIMADZU公司-LC-10AT泵，L-ECD-6A电化学检测器，DGU-12A脱气装置，CBM-10Acommunication bus model，CTO-10A柱温箱。
2　方法
2.1　模型建立
　　将小鼠随机分为7组，每组6只，模型建立方法见表1。在给药期间至处死动物前，每天测定各组小鼠爬杆时间，自发活动记数及游泳时间，MPTP最后一次注射后1O天，将小鼠快速断头取脑，于冰浴下取出左侧纹状体固化称重后置于-80℃冰箱中保存。

表1　模型建立
组　别
N
所用药物
给药量
给药方式
给药时间

A
6
N.S
0.3ml/只
ip
7days

B
6
MPTP
20mg/kg
ip
3days

C
6
MPTP
30mg/kg
ip
1day

D△
5
MPTP
30mg/kg
ip
3days

E
6
MPTP
30mg/kg
ip
7days

F
6
MPTP
40mg/kg
ip
1day

G
6
MPTP
40mg/kg
ip
3days

△动物在末给予MPTP处理时，由于感染而使本组动物在实验结束时仅存活5只

2.2　爬杆实验：
　　参照Nobutaka　Arai；Kazuaki Misugi的突验方法，略加修改，具体测定方法如下：实验用具为自制不锈钢杆长O.5米，直径1cm（其上用胶布缠绕）顶端为一直径2.5cm的木制圆球。动物用药前，先进行爬杆训练，引导动物15秒内由杆顶爬至杆底，每只训练4次，训练完毕即对其进行爬杆时间测定，给药后1-2小时内、对动物进行第二次爬杆时间的测定。具体测定方法如下：持小鼠尾部，将其头向下置于杆顶部（以小鼠双后肢置于球上为准），让其自然爬下，记录小鼠自站于杆顶至双前肢接触杆底平台所需时间，用药后1-2小时重复如上测定。（测定时限120秒，小鼠不能持杆，完全自然下滑者，记录其爬杆时间为120秒）。计算各组小鼠处理前后爬杆时间差值（处理后爬杆时间短于未处理时，其数据记录为O）。
2.3　自发活记数测定：
　　参照李斌等报告的方法，应用中国医学科学院药物研究所研制的CS-2型小鼠自主活动程序仪测定小鼠自发活动记数，当计算机进入测定程序后，将小鼠放入活动箱中（高：13cm，直径:25cm）（每次同时测定4只小鼠，每个活动箱中一只）由计算机自动记录小鼠活动情况，测定每只小鼠5分钟内的活动次数，进行统坟学处理。
2.4　通道式水迷宫测定：
　　应用小鼠通道式水迷宫对小鼠游泳时间进行测定。水迷宫的黑色有机玻璃制成（72cm×37cm×20cm）水深10cm，水温25℃，设四个盲端，终点有台阶。正式测定前，先对各组小鼠进行两盲端，三盲端，四盲端通道式水迷官的游出训练。记录各组小鼠第三日，第四日及第五日的游出时间，及进入盲端的次数，进行统计学处理。
2.5　HPLC法测定纹状体内多巴胺，5-羟色胺及其代谢产物含量：
　　标准品配制：各标准品都溶于流动相中，浓度为O.1mg／ml，使用睦分别稀释到10mg／ml，进样量50ul。
　　色谱条件：Waters公司碳十八反相色谱柱，洗脱液：100mM磷酸氯二钠，O.5mM乙二胺四乙酸二钠，1mM octyl sulfate sodium salt，11％甲醇。调pH为3.85。经过滤脱气后使用。流量1.Oml/min。电化学检测器工作压O.7v，测定温度37℃。标准品在浓度和峰面积间有良好的线性关系r＞O.99。
　　样品予处理：参照周建政等人的方法进行样品的予处理：纹状体组织内加入O.4M高氯酸（每100ml含L-半胱氨酸5mg）O.4ml，制备匀浆，置高速冷冻离心肌12000转4℃离心15分钟。取上清50μl测定其中的多巴胺及其相关代谢产物的含量。
2.6　统计学处理：
　　数据采用SPSS统计软件包中单因素方差分析进行处理，结果表示为Means±SD。

实验结果：

1　注射MPTP后，各组小鼠行力表现：
　　对照组动物在注射生理盐水前后，其行为学表现无明显差异。各MPTP给药组小鼠都出现不同程度的运功障碍，动作退缓，震颤，接毛，财外界刺激反血低下，随著所纺 MPTP刑量增加，用茹寸同延住，功物送功障碍程度增加，症状持装寸同延长。但各组功物症状都于 24小寸后完全消失。
2　MPTP对C57BL小鼠爬杆时间的影晌：
　　对照组小鼠在给予生理盐水前后，爬杆时间无明昱差异。除MPTP小剂量组外，各MPTP给药组小鼠爬杆时间都有所延长，MPTP30mg/Kg及40mg/Kg处理组小鼠爬杆时间与正常对照 组相比，显著延长（p＜O.05）见表2

表2　不同剂量MPTP对C57BL小鼠爬杆时间的影响
爬杆时间（秒）

group
Control
MPTP（20mg/kg）
MPTP（30mg/kg）
MPTP（40mg/kg）
1day
0.355±4.3
1.95±2.8
68.1±35.3*
85.3±33.5*
3days
0
6.15±4.1
59.4±45.7*
81.18±35.5*
7days
0

54.42±38.3*

　Data are expressed as means±SD。
　*P<0.05，compard with control group
3 MPTP对C57BL小鼠自发活动记数的影响：
　　在给予MPTP的过程中，除小剂量组外（20mg/kg），各MPTP给药组小鼠都出现自发活动减少，其中MPTP30mg/kg及40mg/kg处理组小鼠与正常对照组相比，自发活动明显减少（P＜0.05）见表3

表3　不同剂量MPTP对C57BL小鼠自发活动记数的影响
自发活动次数

group
Control
MPTP（20mg/kg）
MPTP（30mg/kg）
MPTP（40mg/kg）
1day
131.8±18.1
117.6±37.2
23.95±16.55*
35.9±21.79*
3days
102.3±23.6
92.6±36.1
30.23±16.7*
14.8±12.6*
7days
79.87±13.8

14.7±11.45*

　Data are expressed as means±SD。

　*P<0.05，compard with control group
4　MPTP对C57BL小鼠通道式水迷宫游出时间及错误次数的影响：
　　各组小鼠游出时间无差异，错误次数无差异，见表3，表4
表4　不同剂量MPTP对C57BL小鼠通道式水迷宫游出时间的影响
游出时间（秒）

group
Control
MPTP（20mg/kg）
MPTP（30mg/kg）
MPTP（40mg/kg）
1day

49.06±26.24
33.42±22.06
3days

38.5±29.1
44.55±38.03
30.52±20.38*
7days
42.32±30.3

52.93±26.97

　Data are expressed as means±SD。
　*P<0.05，compard with control group

表5　不同剂量MPTP对C57BL小鼠通道式水迷宫错误次数的影响
　错误次数

group
Control
MPTP（20mg/kg）
MPTP（30mg/kg）
MPTP（40mg/kg）
1day

1.24±1.17
1.18±1.25
3days

0.9±1.01
1.725±2.86
0.58±0.48*
7days
1.73±2.49

2.21±2.66

　Data are expressed as means±SD。
　*P<0.05，compard with control group
5　MPTP对C57BL小鼠脑内单胺类神经递含量的影响：
　　采用高效液相色谱——电化学检测法，测定各组小鼠纹状体DA，5-HT，及共代高产物的含量，发现各MPTP处理组多巴胺（DA）及其代谢产物二羟基苯乙酸（DOPAC）的含量与对照组相比都有显著的下降（P<0.05）,高香草酸(HVA)的含量与对照组相比无明显差异,去甲肾上腺素(NA)的含量在对照组和各MPYP处理组间无明显差异,5-羟色胺(5-HT)及其代谢产物5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)的含量在对照组和各MPTP处理组间无明显差异,见表6。

表6　MPTP对C57BL小鼠纹状体DA，NA，5-HT及其代谢产物含量的影响
（ng/mg湿组织重）
group
n
DA
DOPAC
HVA
NA
5-HIAA
5-HT

Control

MPTP30mg/kg×7
MPTP40mg/kg×3
MPTP30mg/kg×3
MPTP20mg/kg×3
MPTP40mg/kg×1
MPTP30mg/kg×1
6

6
6
3Δ
6
6
6
3.67±1.31

1.08±0.56*
1.19±0.78*
1.35±0.88*
1.69±0.98*
1.693±0.55*
2.41±0.79*
1.06±0.69

0.28±0.20*
0.19±0.18*
0.41±0.46*
0.19±0.18*
0.47±0.37*
0.44±0.16*
O.48±0.20

0.22±0.20
0.21±0.11
0.41±0.22
0.30±0.14
0.26±0.13
0.25±0.15
0.66±0.31

0.55±0.42z
0.81±0.63
0.49±0.53
0.84±0.49
0.57±0.35
0.75±0.27
0.0057
±0.17
<DL
<DL
<DL
<DL
<DL
<DL
0.35±0.21

0.22±.24
0.23±0.11
0.46±0.28
0.31±0.21
0.25±0.19
0.28±0.13

　Data are expressed as Means±SD。
　*P＜0.05，compared with control group
　　△动物在未给予MPTP处理时，由于感染而使本组动物仅存活5只，其中3只用于本项检测。
讨论：

　　临床帕金森病人的行为变化为运动协调能力降低，在本次实验中，采用爬杆突验作为测定动物协调运动功能力的指标。我们观察到，在给予MPTP腹腔注射后，除小剂量组（20mg/kg）外，其它各组小鼠协调运动能力明显降低，与正常对照组有显著性差异。小鼠自主活动标志着动物中枢神经系统的兴奋状态，当中枢神经系统兴奋时，自主活动加强，当中枢神经系统抑制时，自主活动减少。在给予MPTP腹腔注射后，除小剂量组（20mg／kg）外，其它各组小鼠自主活动减少。水迷官是对动物学习记忆能力的测定方法，本次实验中，末见各组动物在游出时间和错误次间存在差异，表明MPTP腹腔注射后形成的PD小鼠模型．是较为特异的运动功能障碍模型，不伴有明显智力障得。本次实验中，同时也发现小剂量MPTP处理组，在爬杆实验和自发活动记数测试中未出现明显的行为学异常，与对照组无差异。但其纹状体中多巴胺及其代谢产物的含量动较对照组有明显差异。表明，动物在出现明显行为学异常常时，其脑内递质的改变已相当明显。

　　多巴胺是一种抑制性神经介质，在黑质内合成的多巴胺通过黑质纹状体束到达纹状体而发挥作用。如果其抑制作用过分降低，将会导致帕金森病临床症状的出现。据报道，当多巴胺能神经元减少60-80%时，多巴胺含量降至正常的30%时，就会有帕金森氏病的症状出现。多巴胺代谢的最终产物主要是高香草酸（HVA），还有二羟苯乙酸（DOPAC）等，其中，以HVA的含量最高．测定HVA可作为间接反应脑内多巴胺含量变化的指标。5-羟色胺（5-HT）在中脑中缝核中的含量最高，其次是纹状体系统。5-HT的代谢终产物主要是5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）。5-HT是一种抑制性神经递质，存在于由中缝核发向纹状体的纤维中，对后者起抑制作用。去甲肾素是广泛存在于脑中的一种神经递质，其代谢主要产物是3-甲氧基4-羟基苯乙酸（MHPG）。报道帕金森病患者脑脊液中MHPG水平有所下降，且去甲肾上腺素下降的病例多伴有痴呆。甲肾上腺素，5-羟色胺，和多巴胺同属单胺类神经递质，有着相似的酶系统．在帕金森病人累及多巴腔系统，但去甲肾上腺素和5-羟色胺可能受到不同程度的影晌。在本实验中，不同量MPTP给药组小鼠都显示出不同程度的多巴胺及其代谢产物的下降，这与以往的报道相一致并且友现，多巴胺类神经递质下降程度随给药剂量的增加和给药时间的延长而加剧，实验中，我们还发现，小鼠脑蚊状体内多巴胺含量与其代谢产物含量的下降并不完全一致，揭示在不同剂量MPTP在毁损单胺类神经元的同时，可能会对单胺类递质代谢酸产生不同的影响，从而影响此种神经递质代谢产物的含量。

　　我们认为：在MPTP致C57BL小鼠PD动物模型中，MPTP的应用剂量和途径应依据不同的研究目的而进行，例如，评价保护性复合物的药效时，应该采用多巴胺能神经元缺失较多，纹状体中多巴胺含量下降幅度较大的模型．而侧重于观察生化，形态学改变时应该采用较轻微的动物损伤模型。