保肝宁对HSC-T6细胞凋亡的影响

作者：张绪富 谭焱 贺松其 吕志平

【摘要】 目的观察复方保肝宁对HSC-T6细胞凋亡的影响，以进一步探讨保肝宁抗肝纤维化的作用机理。方法引进HSC-T6细胞株并传代培养。用复方保肝宁给正常大鼠灌胃，制备药物血清，温育培养细胞。用吖啶橙染色法和流式细胞仪测定细胞凋亡。结果正常大鼠血清培养组HSC-T6细胞核DNA为黄色或黄绿色均匀荧光，自身凋亡率为（9.67±0.57）%，复方保肝宁药物血清一倍、两倍剂量组细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色染色，甚或见黄绿色碎片，凋亡率分别为（22.73±0.78）%，（23.97±2.50）%，明显高于正常对照组，差异有显著性（P＜0.01）。结论 体外培养的HSC具有一定程度的自身凋亡发生，复方保肝宁的促肝星状细胞凋亡作用可能是其抗肝纤维化作用的主要机理之一。

【关键词】 保肝宁 肝纤维化 肝星状细胞 细胞凋亡

我们前期实验表明，保肝宁药物血清能显著抑制星状细胞（HSC）增殖并抑制Ⅰ型胶原含量的表达［1］。为了进一步了解该方的抗肝纤维化作用机理，我们采用体外培养HSC的血清药理学方法，运用吖啶橙染色法和流式细胞仪技术检测星状细胞凋亡，探讨该方的可能作用机理。

1 材料与仪器

1.1 HSC-T6细胞株来源HSC-T6星状细胞系来自美国加利福尼亚旧金山总医院肝病中心实验室Friedman教授，由上海中医药大学肝病研究所馈赠。

1.2 试剂碘化丙啶（PI染液）上海生工出品，Acridine orange (吖啶橙) 上海生工出品，High Glucose DMEM干粉为Gibco BRL产品，小牛血清购于杭州四季青生物工程研究所。

1.3 仪器荧光显微镜OLYMPUS BHT；流式细胞仪BECTON FACS420；Olympus光学显微镜，日本Olympus公司。CO2培养箱，美国NAPCO 5410 水套式。电热恒温水浴箱，上海泸南科学仪器联营厂出品。96孔酶标板、各式培养板为丹麦NUNC公司产品。

2 方法

2.1 药物、药物血清的制备

2.1.1 复方保肝宁药物的制备复方保肝宁由四逆散合北芪、黄芩、丹参、桃仁、鳖甲和白背叶根等组成。中药由南方医科大学中医药学院中药药理教研室专家鉴定并打成粉末，经水煎后，75℃水浴浓缩，制成1，2倍两种剂量水剂，分别含生药1.2 g/ml和2.4 g/ml 。

2.1.2 药物血清的制备［2］雄性Wistar大鼠15只，随机平均分为3组：正常血清对照组，中药1倍，2倍剂量组。灌药1次/d，每次10 ml/kg，连续7 d，正常血清对照组给予相应剂量的生理盐水。最后1次灌药（灌药前禁食不禁水12 h）1 h后，3％戊巴比妥（1.5 ml/kg）腹腔麻醉，腹主动脉采血，3 000 r/min×10 min分离血清，56℃，30 min水浴灭活，0.45 μm微孔滤膜过滤，-70℃保存。

2.2 HSC-T6细胞复苏、冻存、培养与传代配置DMEM（High gluocose）培养基1 000 ml：DMEM1包、NaHCO3 2.5 g、HEPES 2.38 g、链霉素0.1 g、青霉素0.062 5 g、双蒸水加至1 000 ml。0.25%Trypsin -0.02% EDTA胰酶100 ml：Trypsin 0.25 g、EDTA 0.02 g、D-Hank's100 ml。谷氨酰胺10 ml：NaCl 0.085 g、谷氨酰胺292 mg、加H2O至10 ml。10％小牛血清DMEM培养HSC-T6细胞。待细胞贴壁后换5%小牛血清的DMEM（H）培养基，以1%谷氨酰胺的比例添加至培养基，每2周加1次。细胞长满单层后，胰酶消化，传代培养。细胞冻存时以细胞悬液1 ml 加DMSO100 μl、小牛血清900 μl，放至-80℃冰箱或液氮罐中冻存。细胞复苏时，将细胞迅速复温至37℃，无血清培养基洗1遍，离心，去上清，加10%小牛血清DMEM（H）培养。

2.3 吖啶橙染色法观察保肝宁对HSC-T6凋亡的影响［3］

2.3.1 实验分组和细胞培养复苏后处于对数生长期的HSC-T6细胞，胰酶消化，以10％小牛血清的DMEM培养基均匀种于培养瓶中，长满亚单层后，吸出培养液，分别加入含1，2倍剂量组5％复方保肝宁药物血清的DMEM（H）培养液，并以含5％正常大鼠血清的培养液作正常对照。作用48 h后，分别收集各组HSC。

2.3.2 具体实验步骤①配备吖啶橙储存液：10 mg吖啶橙溶解于100 ml PBS中，pH 4.8～6.0滤过，4℃避光保存。②制备活细胞悬液，浓度约107/ml。③取95 μl细胞悬液，加5 μl的吖啶橙储存液混匀。④吸1滴混合液点洁净玻片上，直接用盖玻片封片。⑤荧光显微镜选用激光滤片BG12或BV等，阻断滤片用515 nm或SP3。

2.4 流式细胞术分析保肝宁对HSC-T6的凋亡影响［3］实验分组和细胞培养方法同上，每组设3标本重复。具体实验步骤如下：①配置PI染液：100 μg/ml，Rnase100 μg/ml，4℃避光保存。②收集细胞2×106/ml离心（500～1 000 r/min）5 min，去上清，3 ml PBS洗。③在细胞团缓慢加入80％（4℃）乙醇，固定1～24 h。④3 mlPBS重悬，400目钢网过滤，500～1 000 r/min，5 min离心去上清。⑤加入1 ml PI染液4℃作用30 min。⑥上机检测：流式细胞仪检测细胞内DNA含量，由488 nm激发，用＞610 nm滤过镜检测。

2.5 统计学方法上述各项指标均±s表示，用统计软件SPSS 10.0进行单因素变量方差分析和SNK两两比较。

3 结果

3.1 荧光染色法观察复方保肝宁药物血清对HSC-T6细胞凋亡的结果在荧光显微镜下，正常大鼠血清培养HSC细胞核DNA为黄色或黄绿色均匀荧光，细胞质和核仁的RNA为橘黄色或橘红色荧光（见图1）。保肝宁药物血清组可见散在细胞凋亡，细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色染色，甚或见黄绿色碎片（见图2～3）。

图1 正常组HSC-T6 细胞吖啶橙染色 图2 1倍剂量组HSC-T6 细胞吖啶橙染色

3.2 流式细胞术分析保肝宁药物血清对HSC-T6凋亡的影响保肝宁药物血清组的DNA直方图均可见到明显的亚二倍体峰（sub-G1峰）存在。1倍，2倍剂量药物血清组的凋亡率分别为（22.73±0.78）％（见图4），（23.97±2.50）%（见图5），明显高于正常对照组（9.67±0.57）%（见图6），P＜0.01。1倍，2倍剂量组间未见剂量依赖关系（P＞0.05）。 4 讨论

肝纤维化是各种慢性肝病进展为肝硬化的必经途径，其实质是肝内ECM的合成与降解失去平衡，导致ECM尤其是胶原的过度沉积和分布异常。尽管几种肝脏细胞均能合成ECM，目前一致认为，激活的HSC为肝纤维化时产生各种ECM成分的主要细胞群［4，5］。对HSC的功能特点及其激活调控机制的研究已成为近年来肝纤维化发生机制及抗肝纤维化药物研究中的热点之一。

凋亡也称为程序性细胞死亡。过去的三十多年来，人们已逐渐认识到凋亡对生理和病理性细胞数目减少起主导调控作用。凋亡通过和增殖共同作用调控着组织内细胞总数。现已有实验表明，静息状态的HSC未见凋亡发生，但随着HSC的激活，出现CD95(APO-1/Fas)、CD95L (APO-1/Fas-ligand)的表达和细胞凋亡，在完全激活的HSC中凋亡率达18%［6］。免疫组化染色显示随HSC的活化，HSC出现自发性凋亡，而且凋亡的发生随激活进程而逐渐增加，肝损伤恢复期HSC总数减少，HSC凋亡比例亦随之减少，表明活化HSC主要通过凋亡终结其活化。活化的HSC凋亡在实验性肝纤维化（四氯化碳和胆管结扎模型）自愈过程中起到了关键作用［7，8］。相反，阻止凋亡和延长活化的HSC生存能够促进肝纤维化进程［9］。目前，通过促进HSC凋亡减少其数目而抗肝纤维化的研究正在取得进展。实验表明，真菌代谢物胶霉素在体内外均能诱导HSC凋亡。给予CCl4肝纤维化大鼠胶霉素治疗可导致活化HSC数目减少50%（通过凋亡介导），HSC凋亡的同时肝脏内纤维化程度也显著减轻［10］。中药复方861合剂［11］、丹参单体IH764-3［12］也可通过抑制HSC增殖、促进其凋亡而达到抗肝纤维化效果。正是考虑到HSC增殖和凋亡在肝纤维化形成和修复中的重要性，目前，抑制HSC活化增殖和促进其凋亡作为肝纤维化的治疗策略已成为国内外学者的共识［13］。

本实验研究表明，HSC-T6细胞传代培养48 h后的自身凋亡率为（9.67±0.57）%，表明其自身可通过部分凋亡而使细胞数目减少，这可能与其为表型活化的HSC，具有一定的凋亡易感性有关，与文献报道相一致［6］。低、中剂量组药物血清均能促进HSC凋亡，但组间未见明显差异。保肝宁药物成分复杂，其抗肝纤维化的内在机制是多方面的，其通过何种机制诱导HSC凋亡并抑制其增殖尚待进一步深入研究。

【参考文献】
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