半枝莲提取物诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及其对凋亡相关蛋白表达的影响

(整期优先)网络出版时间:2019-03-25
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作者:韦鹏涯 浦洪琴 韦星 宾晓芸 李朝敢

【摘要】   目的探讨半枝莲提取物(Scutellaria barbata D. Don extract, SBE)对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2,Survivin和Caspase-3表达的影响。方法体外培养SMMC-7721细胞,以2.5,5和10 mg·L-1SBE处理48 h,并以2.5 mg·L-1顺铂(DDP)作为阳性对照。用MTT法检测细胞抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,二步法免疫组化检测Bcl-2,Survivin和Caspase-3蛋白表达。结果 与正常对照组相比,SBE各浓度组细胞抑制率显著升高(P﹤0.001),细胞凋亡率明显上升(P﹤0.01),Caspase-3蛋白表达显著上升(P<0.01或P<0.05),Bcl-2和Survivin蛋白表达明显下降(P<0.01或P<0.05)。结论 SBE具有诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用,其分子机制可能与上调Caspase-3蛋白表达以及下调Bcl-2和Survivin蛋白表达有关。

【关键词】 半枝莲 SMMC-7721细胞 细胞凋亡 Bcl-2; Survivin Caspase-3

  Abstract:ObjectiveTo explore the apoptosis-inducing effect of Scutellaria barbata D. Don extract(SBE)and the expression of apoptosis associated proteins Bcl-2, Survivin and Caspase-3 on human liver cancer SMMC-7721 cells. MethodsSMMC-7721 cells were treated with 2.5, 5 and 10 mg·L-1 SBE for 48h, and the cells were treated with 2.5mg·L-1 DDP as positive control. The inhibitory rat was evaluated by MTT assay. The apoptotic rate was determined by flow cytometry. The expression of Bcl-2, Survivin and Caspase-3 proteins were detected by two-step immunohistochemical staining.ResultsCompared with control group, the inhibitory rate was increased obviously(P<0.001), the apoptotic rate was increased markedly(P<0.01), the expression of Caspase-3 protein was increased significantly(P<0.01 or P<0.05), while Bcl-2 and Survivin proteins were decreased markedly (P<0.01 or P<0.05) in SBE groups. ConclusionSBE can induce apoptosis of liver cancer SMMC-7721 cells. The molecular mechanism might be related to up-regulating the expression of Caspase-3 and down-regulating the expression of Bcl-2 and Survivin apoptosis related proteins.

  Key words:Scutellaria barbata D. Don; SMMC-7721 cells; Apoptosis

  半枝莲Scutellaria barbata D. Don,SB属于唇形科植物,临床上常用于肝癌、肺癌、胃癌和鼻咽癌等多种癌症防治,但具体的抗癌机制尚不明确。研究发现,半枝莲提取物(SBE)能诱导白血病K562细胞凋亡,其作用机制可能与Caspase3的表达升高和活化有关[1];SBE可诱导人肝癌QGY-7701细胞凋亡,并能上调Bax和下调Bcl-2的表达[2];SBE还通过上调凋亡相关基因蛋白Fas表达,促进人肝癌Hep-G2细胞凋亡[3]。本研究观察了SBE诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡作用,并检测凋亡相关蛋白Bcl-2,Survivin 和Caspase-3表达情况,以探讨SB抗肝癌作用及其初步分子机制,为临床应用提供实验依据。

  1 器材与方法

  1.1 材料

  1.1.1 细胞

  人肝癌细胞株SMMC-7721由中科院上海细胞生物研究所细胞库提供。

  1.1.2 试剂与仪器

  胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品,碘化丙啶(PI)为Sigma公司产品,四甲基偶氮唑蓝(MTT)为上海普飞生物技术有限公司产品,鼠抗Bcl-2、Survivin和Caspase-3单克隆抗体为Santa cruz公司产品,PowerVisionTM免疫组化检测试剂盒为北京中杉金桥生物技术公司产品。wellscan K3 酶标仪(芬兰),BX51型显微镜(OLYMPUS),Facscallbar型流式细胞仪(USA)。

  1.2 方法

  1.2.1 药物提取

  按文献[4]方法,取SB(购于广西壮族自治区百色市中医医院中药房)干品粗粉50 g,用75%乙醇浸泡3 h,共浸泡3次,温度40℃,合并滤液,旋转蒸发器干燥得SB浸膏,二甲基亚枫(DMSO)溶解浸膏样品配制成浓度为10mg·ml-1提取物药液, 再以细胞培养液稀释成所需浓度供实验用。

  1.2.2 细胞培养和药物处理

  肝癌SMMC-7721细胞,以含100 U·ml-1青霉素,100 μg·ml-1链霉素、10% FBS的RPMI 1640培养液,在37℃,5%CO2的培养箱中培养,细胞生长至对数增殖期,更换含0,2.5,5,10 mg·L-1SBE新鲜培养液,用DDP(2.5 mg·L-1)为阳性对照组,药物作用时间均为48 h。

  1.2.3 细胞抑制实验(MTT法)

  将对数生长期的SMMC-7721细胞移入96孔培养板中,细胞密度约为1×104个/ ml,每孔加入200 μl细胞悬液,培养24 h。吸弃孔内原培养液,加入含SBE的10%胎牛血清RPMI 1640培养液200 μl,每个药物浓度设4个平行复孔,另设DDP为阳性对照组和空白对照孔。培养到44 h,每孔加入MTT(5 mg·ml-1)20 μl,继续培养4 h后终止培养,小心吸弃孔内上清液,每孔加入DMSO 150 μl,用震荡混合仪震荡10 min。选择492 nm波长酶标仪测定每孔光吸收值(OD值)。实验重复3次。按下公式计算抑制率:抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

  1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

  药物作用后,收集各组细胞约1×106个,1 000 r/min离心5 min,弃去培养液;PBS冲洗2次,加入70%预冷的乙醇固定,4℃,1~24 h;离心弃去固定液,PBS冲洗去乙醇;PBS重悬细胞,400目的筛网过滤1次,离心弃去PBS;加入RNase A(终浓度为60 μg·ml-1),摇匀,37℃温育30 min,加入PI(终浓度为50 μg·ml-1),4℃避光30 min;每份标本测定(2~4)×103个细胞,流式细胞仪检测,用MoufitLT软件分析结果。

  1.2.5 免疫组化法检测基因蛋白表达

  按照二步法免疫组化检测试剂盒说明书操作:药物处理细胞后,收集细胞,PBS冲洗两次;制成细胞悬液涂片,风干后丙酮固定15 min;3%过氧化氢孵育5 min,以阻断内源性过氧化物酶;滴加一抗(稀释1∶100),室温90 min,PBS冲洗,2 min×3次;滴加IgG抗体-HRP多聚体20-30 min,PBS冲洗,5 min×3次;用DAB溶液显色;蒸馏水冲洗、苏木素衬染、脱水、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。结果分析:Bcl-2蛋白定位于胞膜或胞浆,Survivin和Caspase-3蛋白定位于胞浆,细胞膜或细胞浆染为棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。利用CMLAS彩色病理图像分析系统进行分析,随机计数低倍镜下6个视野中的阳性细胞数和总细胞总数,求出每组细胞的阳性率。

  1.2.6 统计方法

  实验数据采用±s表示,用SPSS11.5统计软件进行统计学处理,参数统计采用t检验。

  2 结果

  2.1 各组SMMC-7721细胞抑制率的比较细胞抑制实验结果显示(表1), SBE各浓度组的细胞抑制率均显著高于正常对照组(P<0.001)。表1 各组SMMC-7721细胞抑制率的比较(略)

  2.2 各组SMMC-7721细胞凋亡比较在DNA直方图上(图1),SBE各浓度组和DDP组G1峰前均出现凋亡细胞所特有的亚二倍体峰(sub-G1),即细胞凋亡峰;正常对照组,2.5,5,10 mg/L-1 SBE组和DDP组的细胞凋亡率分别为(1.57±0.68)%,(8.06±1.02)%,(15.45±0.90)%,(24.03±2.23)%和(19.46±1.14)%,SBE各浓度组细胞凋亡率均显著高于正常对照组(P﹤0.01,n=6)。

  2.3 各组SMMC-7721细胞基因蛋白表达比较

  与正常对照组比较,SBE各浓度组细胞Bcl-2和Survivin蛋白表达明显下降(P﹤0.01或P﹤0.05),Caspase-3蛋白表达明显上升(P﹤0.01或P﹤0.05)。见表2。表2 各组细胞Bcl-2、Survivin和Capase-3蛋白表达比较(略)

  3 讨论

  本实验观察到SBE对SMMC-7721细胞具有明显的抑制增殖和诱导癌细胞凋亡的作用,并呈现一定的剂量依赖性。SB含有黄酮类化合物、生物碱、甾类、鞣质等,而SB乙醇提取物主要是黄酮类化合物[5]。研究发现,植物的某些成分如黄酮类和生物碱等化合物具有明显的抗肿瘤作用,并且这种作用的机制之一是诱导细胞凋亡[6]。由此推测,本实验诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的SB活性成分主要是黄酮类化合物,但其确切的抗癌活性成分尚待进一步研究。

  Caspase-家族是Fas/Apo-1介导的凋亡信号转导途径的关键效应分子,又是多种凋亡途径共同作用的因子,其蛋白表达水平的高低决定着细胞凋亡程度[7]。本实验结果显示,Caspase-3蛋白表达随着SBE浓度增高而升高,提示SBE可以通过影响Caspase-3蛋白水平的表达,激活细胞凋亡程序,进而诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡。

  Bcl-2蛋白的功能是阻遏细胞凋亡,多种化疗药物及中药的抗肿瘤活性均与Bcl-2基因表达下调有关[8]。生存素(Survivin)是最近发现的凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis protein, IAP),是迄今发现最强的凋亡抑制因子[9]。Survivin抗凋亡作用已被研究证实,它不仅通过阻断线粒体细胞色素C释放,与下游凋亡效应因子Caspase-3和Caspase-7结合而对其活性产生直接抑制效应,而且还通过与纺缍体纤维的结合,间接抑制Caspase对纺缍体的水解作用,有利于保护有丝分裂细胞的完整性,从而抑制细胞凋亡[10]。另外,Survivin与细胞周期素依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4, CDK4)形成Survivin- CDK4复合体,释放出P21,而P21能进一步与线粒体Caspase-3结合,抑制其活性,阻止细胞凋亡[11]。本研究结果发现,与正常对照组比较,SBE各浓度组Bcl-2和Survivin蛋白表达明显下降,提示SBE诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡机制可能与下调Bcl-2和Survivin蛋白表达有关。

  在SBE诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡分子机制中,Caspase-3,Bcl-2和Survivin之间关系如何,其他基因是否参与,尚待深入研究。我们相信SB作为一种传统的抗肿瘤中草药,随着其抗肿瘤活性成分及机制的进一步明确,在肿瘤的预防和治疗中必将展现其广阔的应用前景。

参考文献
  [1]谢珞琨,邓 涛,张秋萍,等. 半枝莲提取物诱导白血病K562细胞凋亡[J].武汉大学学报(医学版), 2004, 25(2): 115.

  [2]林敬明, 刘 煜, 罗荣城. 半枝莲抑制人肝癌QGY-7701细胞增殖研究[J].南方医科大学学报, 2006,26(5):591.

  [3]林敬明, 刘 煜, 罗荣城. 半枝莲提取物抗人肝癌Hep-G2细胞增殖及其机制研究[J].南方医科大学学报, 2006,26(7):975

  [4]袁崇均, 王 笳, 杨 红,等. 正交试验法优选半枝莲提取工艺的研究[J].华西药学杂志, 2002, 17(2): 112

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  [6]敖琳,曹仕,徐 颖, 等. 昆明山海棠总生物碱诱导HL-60细胞凋亡的观察[J].第二军医大学学报, 2001,23(11):273.

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  [8]Konturek PC, Konturek SJ, Sulekovxa Z, et al. Expression of hepatocyte growth factor, transforming growth factor alpha, apoptosis related proteins Bax and Bcl-2, and gastrin in human gastric cancer[J].Aliment pharmacol ther, 2001, 15: 989



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  [10]Andrade F, Roy S, Nicholoson D. et al. Granzyme B directly and efficiently cleaves sereral downstreem caspase substrates: implication for CTL-induced apoptosis[J]. Immunity, 1998, 8(4): 451

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