简介:摘要目的建立高效的人肠三叶因子(ITF)重组表达及纯化策略,观察重组人ITF(rhITF)对烧伤小鼠肠黏膜损伤与修复的作用并探讨其机制。方法采用实验研究方法。采用新型酵母表达载体pGAPZαA和酵母菌X33重组表达ITF,并通过金属螯合亲和层析与阴、阳离子交换层析法纯化蛋白,行非还原十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白质印迹法鉴定rhITF。rhITF与胃蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液按体积比1∶1混合,分别作用0.5、1.0、1.5、2.0 h和1.0、2.0、4.0 h后行非还原SDS-PAGE,分析rhITF的稳定性。按随机数字表法将105只6~8周龄BALB/c雄性小鼠分为假伤组(30只)、单纯烧伤组(45只)、烧伤+rhITF组(30只)。将单纯烧伤组和烧伤+rhITF组小鼠背部造成30%体表总面积Ⅲ度烧伤,假伤组小鼠模拟致假伤,烧伤+rhITF组小鼠伤后灌胃1 mg/kg rhITF,其余2组小鼠伤后给予等量生理盐水。伤后24 h,取15只单纯烧伤组小鼠,制备烧伤血清,用于细胞实验。伤后3、5、7 d,每组各取10只小鼠处死后取小肠组织,苏木精-伊红染色观察肠黏膜病理变化,分光光度法和酶联免疫吸附测定法测定肠组织二胺氧化酶(DAO)及乳酸脱氢酶(LDH)活性。取3批人结直肠腺癌HT-29细胞,分为阴性对照组、25 μg/mL rhITF组、50 μg/mL rhITF组(样本数为3),正常对照组、烧伤血清组、烧伤血清+rhITF组(样本数为3),CK869抑制剂组、CK666抑制剂组和溶剂对照组(样本数为2),分别进行相应处理,Transwell实验观察培养12 h后细胞移行。另取2批HT-29细胞,每批细胞均分为正常对照组、烧伤血清组和烧伤血清+rhITF组(样本数均为6),培养24 h后,蛋白质印迹法检测细胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、磷酸化AMPK(p-AMPK)、Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1(Rac1)及肌动蛋白相关蛋白2/3(Arp2/3)复合亚基1B(ARPC1B)蛋白表达,活化磁珠下拉实验检测细胞Rac1活性。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、SNK检验。结果每升发酵液获得rhITF 82.35 mg,蛋白纯度高达98%,且具有良好的抗原特异性。rhITF在胃蛋白酶和胰蛋白酶溶液中较稳定,与胰蛋白酶溶液作用2.0 h后仍有45%残余,与胃蛋白酶溶液作用4.0 h后仍有90%残余。假伤组小鼠伤后各时间点肠黏膜未见充血、水肿,单纯烧伤组小鼠伤后各时间点肠黏膜主要病理表现为充血、水肿、糜烂及出血。烧伤+rhITF组小鼠伤后3、5 d肠黏膜主要以充血、水肿为主,伤后7 d肠黏膜水肿和充血减轻。与单纯烧伤组比较,假伤组、烧伤+rhITF组小鼠伤后3、5、7 d肠组织DAO和LDH活性显著升高(P<0.05或P<0.01)。培养12 h后,25 μg/mL rhITF组细胞移行数为(58±12)个,显著多于阴性对照组的(16±5)个(P<0.01),显著少于50 μg/mL rhITF组的(123±9)个(P<0.05)。培养12 h后,烧伤血清组细胞移行数为(60±13)个,显著少于正常对照组的(143±11)个和烧伤血清+rhITF组的(138±8)个(P<0.05)。培养12 h后,溶剂对照组细胞移行数为(155±9)个,明显多于CK666抑制剂组的(33±5)个、CK869抑制剂组的(28±5)个(P<0.01)。培养24 h后,烧伤血清组细胞AMPK、Rac1蛋白表达量与正常对照组、烧伤血清+rhITF组相近(P>0.05),p-AMPK蛋白表达量明显高于正常对照组、烧伤血清+rhITF组(P<0.05或P<0.01),ARPC1B蛋白表达量明显低于正常对照组、烧伤血清+rhITF组(P<0.05)。培养24 h后,烧伤血清组细胞Rac1活性明显低于正常对照组、烧伤血清+rhITF组(P<0.05或P<0.01)。结论本研究获得的rhITF具有较高的纯度和超强的稳定性,能耐受极端pH和蛋白酶水解,减轻烧伤小鼠肠黏膜损伤。rhITF能通过抑制AMPK磷酸化维持Rac1-Arp2/3活性,促进肠上皮细胞移行,加速肠黏膜修复。
简介:目的探讨肠三叶因子对内毒素血症幼鼠肠组织Toll样受体(TLR)2、4表达的调节及对肠组织损伤的影响。方法24只10日龄Wistar幼鼠随机分为正常对照组(NS组,n=8,生理盐水1mL/kg腹腔注射);内毒素血症组(LPS组,n=8,LPS5mg/kg腹腔注射);肠三叶因子组(ITF组,n=8,重组肠三叶因子0.1mL/只+LPS5mg/kg腹腔注射)。于腹腔注射后3h处死,留取远端回肠组织观察肠组织病理改变,RT-PCR检测肠组织TLR2、4mRNA的表达。结果光镜下NS组肠组织结构正常,ITF组和LPS组均可见间质和上皮细胞水肿,ITF组较LPS组病变明显减轻。ITF组肠组织TLR2mRNA表达较NS组、LPS组明显增高(P〈0.01);而TLR4mRNA表达较NS组和LPS组明显下降(P〈0.01)。结论肠三叶因子可减轻内毒素血症幼鼠肠组织损伤,这种保护作用可能与其下调TLR4mRNA的表达相关。
简介:背景:在中国恶性肿瘤发病率和死亡率排序中,胃癌分居第二和第三位。探索方法简便、敏感性高的非侵入性指标以筛选出胃癌高危人群接受胃镜检查是胃癌普查的有效途径。目的:探讨三叶因子3(TFF3)作为胃癌筛查血清生物学标记物的临床价值。方法:收集宁波市医疗中心李惠利医院2013年7月—2014年1月49例胃癌患者和29名健康体检者的血清标本,采用ELISA法检测血清TFFs浓度,以ROC曲线及其曲线下面积(AUC)分析血清TFF1、TFF2、TFF3对胃癌的诊断性能,并进一步分析三者与胃癌临床病理特征的关系。结果:胃癌组TFF3血清浓度显著高于健康对照组[(43.57±19.49)ng/mL对(29.97±14.20)ng/mL,P<0.01],两组间TFF1、TFF2血清浓度差异无统计学意义(P>0.05)。血清TFF1、TFF2、TFF3诊断胃癌的AUC分别为0.56、0.56和0.83,TFF3诊断性能最高;以33.0ng/mL为TFF3cutoff值,相应敏感性和特异性分别为63.3%和82.8%,预测胃癌风险的OR值为8.27。TFF3血清浓度与胃癌TNM分期、分化程度和淋巴结转移显著相关(P<0.05)。结论:血清TFF3是一个有应用前景的非侵入性胃癌筛查生物学标记物。
简介:摘要三叶因子1属三叶因子家族(trefoilfactorfamily),它作为一种胃肠道粘膜保护因子,不仅能够保护胃肠道粘膜免受有害物质的侵袭,还能促进细胞迁移和受损粘膜修复。此外,TFF1被认为是一种胃癌抑制因子,亦与胃肠道肿瘤的发生有关。本文就近年来三叶因子1与胃癌关系的研究进展作一综述。
简介:目的探讨三叶因子3(trefoilfactor3,TFF3)在糖尿病肾病中的价值。方法采用酶联免疫吸附试验检测93例糖尿病肾病及43例年龄、性别匹配的正常体检者血清及尿液TFF3水平,分析其与其他糖尿病肾病指标的相关性。结果糖尿病正常蛋白尿期、微量蛋白尿期及临床蛋白尿期血清TFF3水平分别为(18.05±8.71)、(26.04±7.79)和(57.65±22.42)μg/L,均高于正常体检者,差异有统计学意义(P〈0.05);其水平与血尿素(UREA)、血肌酐(SCr)、血胱抑素C(CysC)呈正相关关系,与肾小球滤过率呈负相关,差异有统计学意义(P〈0.05)。糖尿病患者各期尿液TFF3/Cr水平分别为(342.42±178.75)、(574.78±207.82)和(996.23±491.69)μg/g,均高于正常体检者,差异有统计学意义(P〈0.05),且尿TFF3与尿Alb、A1M和Tf呈正相关关系,差异有统计学意义(P〈0.05)。血清TFF3水平为预测糖尿病肾病的一项独立预测因素(OR=27.845,P=0.003)。结论血清和尿液TFF3水平为观察糖尿病肾病肾功能损害的新指标,其中血清TFF3水平为糖尿病肾病肾功能损害的一个独立预测指标,具有重要的意义。
简介:为了培育优良三叶草品种,利用高加索三叶草和白三叶进行人工杂交,得到的F1代植株移植到田间形成了多个株系。本试验选用了4个结实率较高的F。代株系(分别命名为4-1、1-10、2-4和3-7)和父母本,利用常规染色体压片法,对其种子发芽后进行核型研究。杂交后代的染色体数均为2n=6x=48,与母本高加索三叶草的染色体数相同;杂交后代与亲本的核型类型都为1A型,但核型组成存在一定的差异;核型不对称性由高到低依次为白三叶〉4-1〉1-10〉2-4〉3-7〉高加索三叶苹。试验结果表明,杂交后代株系形态上的差异,不是由染色体数目决定的,而是由核型的不同造成的。