简介:用原子力显微镜(AFM)观察线性DNA并探讨其成像条件。用RT-PCR技术扩增柯萨奇B1病毒VP1基因DNA片段,纯化回收后配制成含和不含1mmol/LMgCl2的水溶液,DNA终浓度为100μg/ml。分别取20μl滴加在新鲜解理的云母片上,吸收1min,用滤纸吸去残液,氮气吹干,在室温下采用MultiModeAFMNanoscopeⅢa的敲击模式成像。同时比较新制备和多次使用过的探析所获得图像的质量,对两种探针进行扫描电镜观察。电泳证明获得了0.83kb的VP1基因DNA线性片段,Mg^2+存在时,DNA在云母片上吸附延展较好,所获图像质量优于无Mg^2+时。新制备的探针较多次使用过的探针所获图像分辨率更高。DNA分子的表现宽度为18±2.9nm,高度为0.8±0.2nm。说明AFM能以高分辨率直接观察DNA分子,Mg^2+的存在和高质量的探针有助于获得理想的图象。
简介:在大肠杆菌中,利用新构建的含T7g-10LRBS以及λ-PR启动子的新型原核表达载体,通过表达gag-pol基因片段,获得了具有天然序列的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核心蛋白p24的高效表达。克隆的gag-pol基因片段在其阅读框架移位区域插入了4bp碱基,其表达的病毒蛋白酶在阅读框架上与gag一致,从而实现了对gag-pol融合蛋白的有效加工,产生成熟的核心蛋白p24及其它产物。重组p24以可溶形式存在,可以被抗p24的单克隆抗体特异识别。测定的N端8个氨基酸序列与从病毒纯化的p24完全一致。在使用硫酸铵沉淀后,采用两步离子柱层析,可将重组蛋白纯化到95%以上的纯度。结果表明,纯化的p24可以作为特异性很强的试剂而用于HIV感染的诊断及病情的预后,并可用于p24的生化及结构分析。