简介:目的采用机械分离和酶消化相结合的方法分离小肠上皮类器官单位(IOUs),并进行形态及功能鉴定,建立稳定的分离培养技术。方法采用机械法剪碎小肠组织,中性蛋白酶和胶原酶联合消化分离组织碎片,差速沉淀法获得IOUs,通过相差显微镜观察IOUs形态,组织学、免疫组化证实其增殖特性及上皮刷状缘完整性,原代二维培养观察IOUs体外增殖及细胞群体组成。结果分离的IOUs大部分形态完整,PAS染色显示连续的刷状缘,并可见杯状细胞,PCNA染色阳性并呈梯度改变,IOUs体外培养可见构成小肠的各胚层细胞。结论采用机械分离和酶消化相结合的方法可以得到形态完整、增殖活跃的IOUs,有望为组织工程小肠构建提供种子细胞。
简介:目的探讨外源性人端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT)基因转染对人胚胎成纤维细胞(hEF)增殖的影响.方法体外培养hEF.应用脂质体转染法将pIRES2-增强性绿色荧光蛋白(EGFP)-hTERT正义重组质粒及pIRES2-EGFP空载质粒分别导入hEF中,相应称为hEF-hTERT和hEF-EGFP.采用蛋白质印迹法(Westernblot)检测正常hEF、hEF-hTERT、hEF-EGFP中hTERT蛋白、分化抑制因子Id1、增殖细胞核抗原(PCNA)及Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达水平.用噻唑蓝(MTT)法测定3种细胞的生长曲线,用流式细胞仪检测细胞周期并计算增殖指数(PI).结果(1)Westernblot:与hEF-EGFP和hEF比较,hEF-hTERT中的hTERT蛋白、Id1、PCNA和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平均较高.(2)MTT法:细胞接种后第4-6天,hEF-hTERT的吸光度(A)值明显高于hEF和hEF-EGFP(P<0.05),接种后1-6dhEF与hEF-EGFP的A值比较,差异均无统计学意义(P>0.05).(3)细胞周期:与hEF-EGFP和hEF比较,hEF-hTERTG0/G1期细胞较少,S、G2/M期细胞较多;其PI为57.47%,高于hEF-EGFP(13.13%)和hEF(17.38%).结论外源性hTERT基因转染可使hEF增殖能力增强.