简介：摘要目的构建一种能够验证内部核糖体进入位点的双荧光素酶报告载体，为验证内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)活性提供了方法。方法以双荧光素酶报告基因载体psiCHECK-2为基础，将发卡结构插入到海肾荧光素酶(R-Luc)基因与萤火虫荧光素酶(F-Luc)基因之间，构建载体psiCHECK-IRES。为了验证载体是否有效，通过同源重组技术将Encephalomyocarditis virus(EMCV)的IRES序列插入到psiCHECK-IRES载体的发卡结构与F-Luc之间，形成载体psiCHECK-IRES-EMCV。以psiCHECK-2质粒做模板建立F-Luc与R-Luc的扩增标准曲线。将psiCHECK-IRES与psiCHECK-IRES-EMCV质粒转染BHK-21细胞，利用RT-qPCR检测F-Luc与R-Luc的拷贝数；将psiCHECK-IRES与psiCHECK-IRES-EMCV质粒分别转染BHK-21细胞，24 h后利用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。结果经过测序证实带有发卡样结构的双荧光素酶表达载体psiCHECK-IRES的载体序列。RT-qPCR结果显示F-Luc与R-Luc mRNA的拷贝数大致相同，证明未出现异常的单顺反子转录本，避免F-Luc读数出现假阳性；插入EMCV IRES的psiCHECK-IRES-EMCV载体表达的F-Luc/R-Luc比值是空载体的53.35倍，证明EMCV的IRES序列能够在构建的载体上起始F-Luc基因的表达。结论本研究构建了可用于验证病毒或者细胞依赖IRES表达的双荧光素酶报告载体psiCHECK-IRES。

简介：摘要目的建立指环病毒7型(TTV7)、8型(TTV8)、10型(TTV10)实时荧光定量PCR检测体系并进行临床验证。方法本研究根据GenBank已发布的TTV7、TTV8、TTV10基因序列设计特异性引物，构建重组质粒pMD19-T-TTV7、pMD19-T-TTV8、pMD19-T-TTV10，以其作为阳性标准品建立了基于FAM-Eclipse探针法的实时荧光定量PCR检测，并进行特异性、敏感性试验与临床样本检测。结果TTV7、TTV8、TTV10的实时荧光定量PCR检测体系标准曲线方程分别为y＝-0.340 2x+114.780 0、y＝-0.351 1x+114.940 0、y＝-0.348 9x+115.020 0，相关系数都在0.99以上，与其他病毒无交叉反应，检测敏感性分别为108拷贝/μl、84拷贝/μl、98拷贝/μl。在临床小儿血清样本中的检测阳性率分别为10.9%、2.1%和4.3%。结论本研究建立的TTV7、TTV8、TTV10实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏性高等特点，可为临床血清样本TTV检测提供一个快速手段。