简介：摘要目的采用RNA干扰技术下调DJ-1基因在肺鳞癌细胞HTB-182中的表达，采用串联亲和纯化质谱(TAP-MS)技术寻找DJ-1在HTB-182细胞系中的相互作用蛋白。方法构建靶向DJ-1基因siRNA慢病毒载体，感染HTB-182细胞(DJ-1 siRNA组)，并设立慢病毒载体对照组(Control siRNA组)及空白对照组，采用Western blot法检测DJ-1蛋白表达水平，建立内源性的DJ-1蛋白表达沉默的si-DJ-1-HTB-182细胞。设计DJ-1的特异性引物，构建带有链霉素结合肽标签(SBP)、钙调蛋白结合肽标签(CBP)的DJ-1表达质粒pNTAP-DJ-1，用脂质体稳定转染细胞系DJ-1 siRNA HTB-182，G418筛选阳性克隆，Western blot进行验证，TAP-MS技术寻找DJ-1的相互作用蛋白。结果DJ-1 siRNA干扰组中DJ-1的蛋白质表达明显低于空质粒(NC)组和空白对照(BC)组(P<0.05)；成功构建了稳定表达pNTAP-DJ-1质粒的HTB-182细胞系；TAP-MS筛选到DJ-1相互作用的三个蛋白质：细胞角蛋白1(Keratin 1)、细胞角蛋白10(Keratin 10)和NADPH氧化酶活化蛋白P47(P47 Px)。结论Keratin 1、Keratin 10和P47 Px可能是DJ-1蛋白的相互作用蛋白。

简介：摘要目的采用RNA干扰技术下调DJ-1基因在肺鳞癌细胞HTB-182中的表达，采用串联亲和纯化质谱(TAP-MS)技术寻找DJ-1在HTB-182细胞系中的相互作用蛋白。方法构建靶向DJ-1基因siRNA慢病毒载体，感染HTB-182细胞(DJ-1 siRNA组)，并设立慢病毒载体对照组(Control siRNA组)及空白对照组，采用Western blot法检测DJ-1蛋白表达水平，建立内源性的DJ-1蛋白表达沉默的si-DJ-1-HTB-182细胞。设计DJ-1的特异性引物，构建带有链霉素结合肽标签(SBP)、钙调蛋白结合肽标签(CBP)的DJ-1表达质粒pNTAP-DJ-1，用脂质体稳定转染细胞系DJ-1 siRNA HTB-182，G418筛选阳性克隆，Western blot进行验证，TAP-MS技术寻找DJ-1的相互作用蛋白。结果DJ-1 siRNA干扰组中DJ-1的蛋白质表达明显低于空质粒(NC)组和空白对照(BC)组(P<0.05)；成功构建了稳定表达pNTAP-DJ-1质粒的HTB-182细胞系；TAP-MS筛选到DJ-1相互作用的三个蛋白质：细胞角蛋白1(Keratin 1)、细胞角蛋白10(Keratin 10)和NADPH氧化酶活化蛋白P47(P47 Px)。结论Keratin 1、Keratin 10和P47 Px可能是DJ-1蛋白的相互作用蛋白。